西格列汀對糖尿病腎病大鼠腎臟的保護作用及機制

胡楊青 顏偉健 李君科 周巧玲

(邵陽醫(yī)學高等?？茖W校附屬醫(yī)院腎內科，湖南 邵陽 422000)

糖尿病腎病(DN)腎臟病理表現(xiàn)為有結節(jié)狀或彌漫性的系膜細胞增殖和細胞外基質積聚，系膜區(qū)的增寬合并基底膜的增厚以及足細胞足突融合，終致腎小球硬化和小管間質的纖維化〔1〕。DN能夠引起多類標志蛋白如腎病蛋白(Nephrin)及超微結構的變化，最終形成蛋白尿。近年來發(fā)現(xiàn)，羥基壬烯酸(4-HNE)及蛋白羰基對腎功能的氧化損傷具有一定的提示作用，轉錄調節(jié)因子(c-Jun)在磷酸化后能夠提升轉錄活性〔2,3〕。二肽基肽酶4(DPP-Ⅳ)能夠較好地發(fā)揮調節(jié)血糖的作用，而西格列汀屬于新型的DPP-Ⅳ抑制劑。因此，分析西格列汀對DN大鼠在上述指標方面產生的腎保護作用的機制，有助于臨床病情的監(jiān)測與治療。

1 材料和方法

1.1分組及模型制備 選擇邵陽醫(yī)學高等?？茖W校附屬醫(yī)院實驗室飼養(yǎng)的60只清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，平均(192.34±2.31)g。根據隨機數(shù)字表法分成對照組、模型組以及干預組各20只，其中模型組和干預組均予以高脂飼料喂養(yǎng)4 w，而后在腹腔中注射產自武漢博士德公司的鏈脲佐菌素，劑量為30 mg/kg，再進行高脂飼料喂養(yǎng)4 w，用斷尾法檢測其隨機血糖，若血糖>16.7 mmol/L表明糖尿病模型已制作成功。而后每日灌胃1次，持續(xù)給藥8 w。干預組給予5 mg·kg-1·d-1的西格列汀(杭州默沙東制藥有限公司，國藥準字：J20120056)灌胃，模型組及對照組給予等量的蒸餾水灌胃。在16 w末時處死大鼠，并留取24 h尿液和血清以及左腎石蠟標本待檢。

1.2檢測方法

1.2.124 h尿微量白蛋白、尿素氮(BUN)以及肌酐(Scr)檢測 利用日立公司生產的7180全自動生化分析儀及酶聯(lián)免疫(ELISA)法檢測24 h尿微量白蛋白、BUN、Scr水平，試劑盒購自武漢博士德公司。

1.2.2免疫組化法測定大鼠DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun表達 腎組織石蠟標本切片，厚度4 μm，撈于免疫組化片上，65℃烤片過夜，后經二甲苯脫蠟，利用無水乙醇和梯度乙醇水化。放進3%的過氧化氫10 min，用0.01 mol/L枸緣酸鹽的緩沖液實施高壓鍋抗原修復。之后加入一抗，37℃下孵育2 h，加入辣根過氧化物酶標記的二抗聚合物，37℃孵育0.5 h，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，再用蘇木精復染3 min。脫水封片后，對結果實施圖像分析，在每張切片中隨機選擇5個視野，檢測平均光密度值。

1.2.3PCR測定DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun mRNA表達 Trizol提出腎臟總RNA，加入50 μl 0.1%焦碳酸二乙酯溶解之后用于反轉錄模板，合成cDNA，實施PCR擴增，以β-actin為內參。反應體系：ROX 10 μl，0.5 μl 15 μmol/L的上游引物，0.5 μl 15 μmol/L的下游引物，以及2 μl的cDNA，另含7 μl的無DNAse及RNAse，總計20 μl。反應條件：94℃預變性10 min，加入活化Tag酶，94℃ 15 s及60℃ 60 s，經45個循環(huán)后結束，計算DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun mRNA表達。利用Western印跡法檢測各組大鼠腎臟組織內4-HNE及蛋白羰基的變化情況。相關試劑盒均購于武漢博士德公司，檢測時嚴格根據試劑盒描述的步驟進行操作。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS21.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗及F檢驗。

2 結 果

2.1各組大鼠生化指標對比 模型組和干預組的體重明顯低于對照組，24 h尿微量白蛋白、BUN及Scr均明顯高于對照組(均P<0.05)；干預組的體重明顯高于模型組，24 h尿微量白蛋白、BUN及Scr均分別低于模型組(均P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠免疫組化DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun光密度值的對比 模型組和干預組DPP-Ⅳ和c-Jun光密度值均高于對照組，Nephrin光密度值低于對照組(均P<0.05)，干預組DPP-Ⅳ和c-Jun光密度值均分別明顯高于模型組，Nephrin光密度值明顯低于模型組(均P<0.05)。見表2。

2.3各組大鼠DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun mRNA表達情況對比 模型組和干預組DPP-Ⅳ和c-Jun mRNA表達水平均明顯高于對照組，Nephrin mRNA表達水平明顯低于對照組(均P<0.05)，干預組DPP-Ⅳ和c-Jun mRNA表達水平均明顯高于模型組，Nephrin mRNA表達水平明顯低于模型組(均P<0.05)。見表3。

表1 各組大鼠生化指標的對比

與對照組相比：1)P<0.05；與模型組相比：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠免疫組化DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun光密度值的對比

表3 各組大鼠DPP-Ⅳ、Nephrin和c-Jun mRNA表達情況對比

2.4各組大鼠腎臟組織內4-HNE及蛋白羰基的表達對比 模型組和干預組腎臟組織內4-HNE及蛋白羰基的表達均明顯高于對照組，且干預組腎臟組織內4-HNE及蛋白羰基的表達明顯低于模型組(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腎臟組織內4-HNE及蛋白羰基的表達對比

3 討 論

DN作為糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，對患者的生活質量具有較大的影響。由于腎小球的基底膜變厚以及細胞外基質的增多均為DN的病理性變化，并可能引起腎小球高濾過及微量蛋白尿產生，因此，在治療原發(fā)性糖尿病的同時，還應監(jiān)測藥物對腎臟的影響〔4～7〕。

24 h尿微量白蛋白、BUN和Scr均為評價腎功能的常用生化指標。本研究結果與郭靜霞等〔8，9〕的報道相符，提示患有DN的大鼠體重和腎功能均明顯下降，但經西格列汀治療后，體重和腎功能逐漸恢復。原因可能是因為西格列汀在治療時控制了糖尿病大鼠的血糖異常，在一定程度上幫助大鼠恢復了體重，并產生了一定的腎保護作用。DPP-Ⅳ是存在于細胞表面的一類絲氨酸蛋白酶，可在腸內高表達，也可通過可溶狀態(tài)存在機體的循環(huán)血液內，對于調節(jié)血糖具有重要的作用。c-Jun屬于c-Jun氨基末端激酶(JNK)的重要下游因子，在活化條件下，c-Jun可被磷酸化，從而強化了轉錄活性。Nephrin是一類特異性表達在足細胞內的蛋白，與維持腎小球濾過屏障的作用密切相關。本文發(fā)現(xiàn)，經西格列汀治療后，DN大鼠的DPP-Ⅳ和c-Jun表達明顯上升，而Nephrin表達明顯下降。分析原因，主要可能與DN大鼠機體內的高糖環(huán)境產生的影響有關〔10,11〕。具體而言，高糖環(huán)境通過一系列的生化反應變化，促進了DPP-Ⅳ和c-Jun的表達上調，并活化了JNK的信號通路，由JNK途徑經磷酸化轉錄因子以及其他的目的因子對基因轉錄進行調節(jié)，從而誘導了Nephrin表達的下調，最終引起蛋白尿的產生〔12,13〕。4-HNE屬于脂質損傷的重要產物，而蛋白羰基的水平高低能夠體現(xiàn)出蛋白氧化損傷程度，二者均可用于評估腎功能的變化。本文提示西格列汀對于DN大鼠的腎臟氧化損傷具有較好的保護作用。分析原因主要是因為西格列汀有效改善了DN大鼠機體內的高糖環(huán)境，進而抑制了各類氧化應激相關因子的表達，并通過改善蛋白尿等作用較好地發(fā)揮了腎保護作用。這在Wang等〔14〕的報道結果中也有類似結論。

綜上所述，西格列汀對于DN大鼠具有較好的腎保護作用，其作用機制主要是通過調節(jié)腎臟JNK信號通路的相關活性而發(fā)揮作用。

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