烏司他丁對(duì)心肺復(fù)蘇大鼠腦組織IL-1β、TNF-α水平及心功能的影響

李 江 賈寶輝

(鄭州大學(xué)人民醫(yī)院 河南省人民醫(yī)院心血管病醫(yī)院CCU,河南 鄭州 450000)

在心臟驟停(CA)過(guò)程中，血流量和氧運(yùn)輸突然停止，導(dǎo)致全身各器官包括大腦、心臟等發(fā)生缺血性損傷。盡管心肺復(fù)蘇術(shù)(CPR)的應(yīng)用已經(jīng)普及，但是血流量減少以及組織氧不足都會(huì)損傷心肌功能，導(dǎo)致血流動(dòng)力學(xué)的不穩(wěn)定以及微血管功能障礙。為了減輕缺血缺氧對(duì)機(jī)體的損傷，調(diào)節(jié)大腦的神經(jīng)機(jī)制會(huì)通過(guò)改善血腦屏障的通透性，減少腦水腫的形成等促進(jìn)腦損傷的恢復(fù)〔1，2〕。 CPR后的心肌損傷常導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重的心功能障礙而死亡〔3〕。烏司他丁(UTI)又稱(chēng)為尿胰蛋白酶抑制劑，可以改善CPR患者的心功能，并對(duì)心臟有一定的保護(hù)作用〔4，5〕。促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)、淋巴因子和細(xì)胞信號(hào)分子，在某些疾病中調(diào)節(jié)細(xì)胞的反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞到炎癥部位并調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存分裂以及增殖分化〔6〕。IL-1β作為免疫和炎癥反應(yīng)介質(zhì)，在腦缺血缺氧中發(fā)揮重要作用〔7〕。腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種促炎癥因子，在體內(nèi)多種重要過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括炎癥、自身免疫、細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化和凋亡等〔8，9〕。本研究旨在探討UTI對(duì)CPR后大鼠心功能及腦組織細(xì)胞因子的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK (蘇) 2011-0003)30只，雌雄各半，體重350～450 g，平均(400.1±11.2)g。隨機(jī)分為空白對(duì)照組、CPR組和UTI組，每組10只。飼養(yǎng)環(huán)境：SPF環(huán)境，溫度(20.2±3.1)℃，相對(duì)濕度60%～80%，通風(fēng)良好，光暗周期12 h∶12 h，飼養(yǎng)1 w適應(yīng)本實(shí)驗(yàn)中心環(huán)境，自由活動(dòng)。術(shù)前12 h禁食。

1.2研究方法

1.2.1動(dòng)物處理 空白對(duì)照組(不進(jìn)行窒息及CPR，只進(jìn)行麻醉和氣管切開(kāi)插管、血管穿刺)；CPR組(靜脈注射生理鹽水4 ml/kg，CA后4 min給藥)；UTI組(UTI 50 000 U/kg+生理鹽水3 ml/kg，50 000 U配制成1 ml，CA后4 min給藥)，UTI注射液購(gòu)自廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司。除空白對(duì)照組外，CPR組和UTI組均根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)〔10〕利用夾閉氣管窒息法建立大鼠CA模型。術(shù)中同步監(jiān)測(cè)左室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末期壓(LVEDP)水平及左心室壓力上升(+dp/dtmax)、下降最大速率(-dp/dtmax)。CPR組大鼠體重(390.8±23.1)g，窒息導(dǎo)致CA時(shí)間(413.1±26.2)s，CPR持續(xù)時(shí)間(631.3±125.1)s；UTI組大鼠體重(395.0±16.4)g，窒息導(dǎo)致CA時(shí)間(406.9±23.1)s，CPR持續(xù)時(shí)間(627.4±79.3)s，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2.2電鏡觀察 實(shí)驗(yàn)中從每組隨機(jī)選出2只大鼠，自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)后2 h應(yīng)用生理鹽水灌注大鼠心臟至血液成為干凈的鹽水為止。對(duì)大鼠施行開(kāi)胸術(shù)取出左心室壁的心肌組織，制作成0.01 cm2的組織塊，經(jīng)過(guò)①2%多聚甲醛-2.5%戊二醛電鏡專(zhuān)用液固定(4℃，2 h)；②二甲砷酸鈉緩沖液沖洗(3次，每次10 min)；③1%鋨酸固定(4℃，2 h)；④梯度酒精脫水；⑤環(huán)氧丙烷置換(2次，每次15 min)；⑥環(huán)氧樹(shù)脂Epon812 包埋劑包埋；⑦超薄切片；⑧醋酸雙氧鈾/枸櫞酸鉛染色。最后采用Philip EM 208s 透射電鏡觀察大鼠心肌細(xì)胞。

1.2.3觀察指標(biāo) ROSC后0 h及6 h均記錄LVSP、LVEDP、±dp/dtmax。CPR后24 h處死大鼠，取出大腦心腦組織標(biāo)本，-80℃冷凍保存。每組取部分心組織進(jìn)行固定，并采用投射電鏡觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)法檢測(cè)各組腦組織中IL-1β、TNF-α的含量，ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件，計(jì)量資料兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1心功能變化 ROSC 0 h三組LVSP、LVEDP及±dp/dtmax比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與ROSC 后0 h比較，ROSC后6 h空白對(duì)照組各指標(biāo)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ROSC后6 h CPR組、UTI組LVSP及±dp/dtmax明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯升高(P<0.05)。與空白對(duì)照組相比，ROSC后6 h CPR組、UTI組LVSP、+dp/dtmax及-dp/dtmax均顯著下降(P<0.05)，而LVEDP顯著上升(P<0.05)；與CPR組相比，ROSC后 6 h UTI組LVSP上升，LVEDP下降(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2電鏡結(jié)果 空白對(duì)照組心肌纖維大小均勻，排列規(guī)則，心肌細(xì)胞正常，胞核大小及形態(tài)均正常，線粒體形態(tài)正常，嵴排列整齊；CPR組心肌纖維排列紊亂，有心肌細(xì)胞的線粒體外膜不完整現(xiàn)象存在，并且有線粒體增生情況出現(xiàn)，嵴變得模糊不易分辨，除此之外，還出現(xiàn)了空泡樣變的線粒體，細(xì)胞核大小及形態(tài)不均勻；UTI組心肌纖維排列尚整齊，胞核大小及形態(tài)均勻，線粒體增生明顯但是嵴結(jié)構(gòu)正常，另外心肌間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3腦組織IL-1β、TNF-α檢測(cè)結(jié)果 三組大鼠腦組織標(biāo)本中IL-1β、TNF-α含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中CPR組、UTI組IL-1β、TNF-α含量均顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，UTI組IL-1β、TNF-α含量均顯著低于CPR組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 ROSC 6 h后三組大鼠心功能的變化

與空白對(duì)照組比較：1)P<0.05；與ROSC后0 h比較：2)P<0.05；與CPR組比較：3)P<0.05

表2 各組腦組織中IL-1β、TNF-α含量比較

與空白對(duì)照組相比:1)P<0.05 ；與CPR組相比:2)P<0.05

3 討 論

CPR是搶救CA患者必不可少的一個(gè)過(guò)程，但是隨之而來(lái)的還有復(fù)蘇后的再灌注損傷，其中心臟的功能障礙最常出現(xiàn)。主要原因是心跳和呼吸的突然停止，導(dǎo)致心臟缺血缺氧，引發(fā)心肌組織損傷，而應(yīng)用CPR使CA患者自主循環(huán)呼吸恢復(fù)后，心肌細(xì)胞重新恢復(fù)供血和供氧而遭受再灌注的損傷，使心功能發(fā)生障礙，嚴(yán)重的會(huì)出現(xiàn)心功能衰竭，甚至出現(xiàn)猝死。炎性細(xì)胞因子的“瀑布”樣連鎖反應(yīng)促進(jìn)了多功能障礙的發(fā)生，其中TNF-α是主要的炎性因子，在炎癥反應(yīng)中起到了核心作用〔11〕；它是激活細(xì)胞因子“瀑布”樣反應(yīng)的促進(jìn)因子，同時(shí)也是機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)/抵御各種致病因子不可缺少的免疫調(diào)節(jié)因子〔12〕。TNF-α含量的高低與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，而且可以誘發(fā)機(jī)體的代謝和血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生明顯的變化，同時(shí)TNF-α可以誘導(dǎo)IL-1β以及繼發(fā)性介質(zhì)的產(chǎn)生，更加促進(jìn)炎癥的連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致炎性因子“瀑布效應(yīng)”〔13〕。有研究發(fā)現(xiàn)，CPR后大鼠體內(nèi)的TNF-α與IL-1β表達(dá)均明顯升高，并且TNF-α和IL-1β的表達(dá)呈正相關(guān)的關(guān)系〔14〕。腦組織發(fā)生缺血缺氧后，活化的星形細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞以及浸潤(rùn)的單核巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，IL-1β通過(guò)介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，因而刺激單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，加重局部的炎癥反應(yīng)。同時(shí)IL-1β可以促進(jìn)白細(xì)胞在炎癥部位的聚集，同時(shí)激活中性粒細(xì)胞參與炎癥的發(fā)展，通過(guò)破壞血腦屏障而加重腦水腫的發(fā)生〔15〕。

本實(shí)驗(yàn)提示經(jīng)過(guò)CPR后的CA大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了心臟的收縮和舒張功能不全。應(yīng)用UTI以后，大鼠的LVSP較CPR組有明顯升高，LVEDP明顯降低，說(shuō)明應(yīng)用UTI后可以改善心肌的舒縮功能。除此之外，心肌細(xì)胞的電鏡觀察結(jié)果顯示，CPR組大鼠的心肌細(xì)胞出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)損傷，而正常心功能的基礎(chǔ)就是心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，說(shuō)明大鼠經(jīng)過(guò)CPR后心肌細(xì)胞出現(xiàn)了嚴(yán)重的損傷，導(dǎo)致了心功能的降低。UTI可以抑制纖溶酶、粒細(xì)胞彈性蛋白酶以及絲氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、α-糜蛋白酶)等多種酶發(fā)生反應(yīng)〔16〕。通過(guò)UTI與絲氨酸蛋白酶相結(jié)合而阻滯這些毒性蛋白酶發(fā)生催化反應(yīng)，從而起到了保護(hù)機(jī)體組織細(xì)胞的作用〔17〕。之前的研究發(fā)現(xiàn)，UTI可以抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)，對(duì)單核細(xì)胞釋放TNF-α具有明顯的抑制作用〔18〕。UTI在中樞系統(tǒng)的保護(hù)作用已有研究證實(shí)〔19〕。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)〔20〕UTI可以抑制氧自由基生成，同時(shí)抑制多種炎癥介質(zhì)如TNF-α、血小板活化因子(PAF)以及IL-6、IL-8等的產(chǎn)生。因此推測(cè)UTI的保護(hù)作用與其抗炎作用有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)使用UTI可以明顯減少PRC大鼠腦組織TNF-α和IL-1β的表達(dá)，推測(cè)UTI在CPR大鼠中通過(guò)減輕炎癥反應(yīng)降低腦組織的損傷。有報(bào)道稱(chēng)UTI在CA導(dǎo)致的腦缺血缺氧中，通過(guò)減輕腦水腫以及炎癥反應(yīng)而起到保護(hù)腦組織的作用〔21〕。然而，本研究仍然存在局限性。CA引起的心臟缺血缺氧與多種炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)，而此次只討論了TNF-α和IL-1β的變化，抑制TNF-α和IL-1β可能是UTI保護(hù)作用的一部分，UTI確切機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

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