MACC1在卵巢癌組織中表達(dá)及對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響

范從紅 李 根 廖曉燕 辜定釬 曹麗麗

(成都市婦女兒童中心醫(yī)院，四川 成都 610106)

卵巢癌早期發(fā)病隱匿，其中有70%的患者在確診時(shí)已經(jīng)是卵巢癌晚期，加上卵巢癌具有發(fā)展迅速、惡性程度高等特點(diǎn)，使得卵巢癌5年內(nèi)的生存率低于30%〔1〕。結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(MACC)1最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌組織，其編碼的蛋白能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲〔2〕。后續(xù)研究表明，MACC1在宮頸癌、肝細(xì)胞癌、腎盂癌、子宮內(nèi)膜癌等癌癥組織中均過(guò)度表達(dá)〔3〕。抑制MACC1后癌細(xì)胞的侵襲能力受到影響，生長(zhǎng)受到抑制〔4〕。本研究通過(guò)小RNA干擾技術(shù)干擾卵巢癌細(xì)胞中MACC1的表達(dá)，探討MACC1對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1組織及細(xì)胞 卵巢癌細(xì)胞A2780由中國(guó)科技院細(xì)胞庫(kù)提供。選取2011年8月至2015年6月在成都市婦女兒童中心醫(yī)院確診并切除的卵巢癌患者卵巢癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織各53例，年齡35～69歲，中位年齡53.87歲，手術(shù)前均沒(méi)有接受放化療，采集組織均經(jīng)過(guò)患者及家屬知情同意，并保存于液氮中。

1.2主要儀器及試劑 MACC1單克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2單克隆抗體、MMP-9單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體均購(gòu)于英國(guó)Abcam；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Transwell小室均購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo。

1.3Western印跡檢測(cè)卵巢癌組織中MACC1的表達(dá)水平 取卵巢癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織，剪碎后，加入冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞后，加入裂解液，勻漿器勻漿后，放在冰上裂解反應(yīng)30 min。吸取蛋白上清液，取5 μl蛋白樣品，按照BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)蛋白樣品的濃度。剩下的蛋白樣品與5倍上樣緩沖液按照4∶1的比例混合后，放在沸水中煮沸5 min。每孔加入40 μl的變性蛋白樣品至聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣孔中，80 V電壓觀察溴酚藍(lán)進(jìn)入濃縮膠和分離膠邊緣時(shí)，調(diào)整電壓至120 V直至溴酚藍(lán)進(jìn)入底端。取出蛋白凝膠，4℃，90 V電壓將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，經(jīng)5%脫脂奶粉在37℃封閉1.5 h后，加入一抗(1∶800)在4℃反應(yīng)過(guò)夜后，再加入二抗(1∶2 000)中在37℃反應(yīng)1.5 h，滴加顯色液，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取出保存在液氮中的細(xì)胞，立即投入到37℃的水浴鍋中，期間進(jìn)行不間斷的震蕩，觀察細(xì)胞完全融化后，轉(zhuǎn)移到離心管中，加入DMEM培養(yǎng)基，混勻后，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入5 ml含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，種植到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶消化液放在37℃消化細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后，棄酶消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求按照不同比例接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，按照Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)將MACC1 siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，按照每106個(gè)細(xì)胞加入100 μl的含有苯甲基磺酰氟(PMSF)1 μl的細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中MACC1表達(dá)水平，步驟參照1.3。

1.5MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有3×105個(gè)細(xì)胞，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中加入100 μl的細(xì)胞懸浮液，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)以不加入細(xì)胞只加入細(xì)胞培養(yǎng)液的組為空白組，培養(yǎng)24 h后，在細(xì)胞中加入20 μl的5 mg/ml的MTT溶液，放在37℃條件下孵育反應(yīng)4 h后，棄掉上清液，加入DMSO溶液150 μl，在低速搖床上震蕩混勻10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm的吸光度。計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=100%×(轉(zhuǎn)染組吸光度-空白組吸光度)/(未轉(zhuǎn)染組吸光度-空白組吸光度)。

1.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞以4×105個(gè)/孔接種到六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過(guò)夜后，用200 μl的移液槍槍頭垂直在細(xì)胞中劃出一條細(xì)痕。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，在細(xì)胞中加入PBS洗滌細(xì)胞3次，將劃出的細(xì)胞洗掉。加入含有2%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。觀察細(xì)胞遷移距離，計(jì)算遷移率。遷移率=100%×(劃痕初始寬度-剩余寬度)/劃痕初始寬度。

1.7Transwell 小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 取出保存在-20℃的Matrigel，放在4℃解凍后，用不含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液按照9∶1的比例稀釋后，加入24孔Transwell小室中，每孔中加入20 μl，放置于37℃環(huán)境中濕化3 h。取轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞A2780，調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升含有5×105個(gè)細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)使細(xì)胞饑餓12 h。在Transwell小室的下室中加入500 μl的含有20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，小室的上室加入200 μl的細(xì)胞懸浮液，放在37℃環(huán)境中培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，甲醇固定后，蘇木素染色，隨機(jī)選擇5個(gè)視野在顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)目。

1.8Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染24 h后的卵巢癌細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，參照1.3步驟檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平，MMP-2、MMP-9一抗均稀釋800倍，二抗均稀釋2 000倍。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MACC1在卵巢癌組織中的表達(dá)水平 MACC1在癌旁組織和卵巢癌組織中的表達(dá)水平依次為0.35±0.03，1.12±0.08。MACC1在卵巢癌組織中高表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MACC1表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 未轉(zhuǎn)染組、siRNA control組、MACC1 siRNA組細(xì)胞中MACC1表達(dá)水平依次為：1.10±0.09，1.09±0.11，0.32±0.02；轉(zhuǎn)染MACC1 siRNA后的卵巢癌細(xì)胞中MACC1 表達(dá)水平降低(P<0.05)。MACC1 siRNA能夠成功干擾卵巢癌細(xì)胞中MACC1的表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖1 Western印跡檢測(cè)卵巢癌組織中MACC1表達(dá)水平

圖2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MACC1表達(dá)水平

2.3細(xì)胞增殖、遷移、侵襲檢測(cè)結(jié)果 siRNA control組細(xì)胞存活率、遷移率及侵襲細(xì)胞數(shù)目與未轉(zhuǎn)染組相比沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。MACC1 siRNA組細(xì)胞存活率、遷移率及侵襲細(xì)胞數(shù)目均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 細(xì)胞存活率、遷移率及侵襲細(xì)胞數(shù)目

與未轉(zhuǎn)染組比較:1)P<0.01

2.4細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 未轉(zhuǎn)染組、siRNA control組、MACC1 siRNA組細(xì)胞中MMP-2表達(dá)水平依次為：0.75±0.06、0.75±0.05、0.06±0.01，MMP-9表達(dá)水平依次為：0.89±0.07、0.88±0.09、0.11±0.02。siRNA control組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染組相比沒(méi)有明顯差異(P>0.05)，MACC1 siRNA組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組細(xì)胞中MMP-2、MMP-9表達(dá)水平

3 討 論

MACC1 最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶中，參與結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、增殖過(guò)程。近年來(lái)的研究表明，MACC1 在胰腺癌細(xì)胞CFPAC-1中表達(dá)上調(diào)，利用siRNA干擾MACC1表達(dá)后的胰腺癌細(xì)胞的增殖能力降低，遷移能力受到抑制〔5〕。后續(xù)的報(bào)道證實(shí)，MACC1在宮頸癌、肝癌、肺癌、胃癌等多種癌癥組織中過(guò)度表達(dá)，而抑制MACC1后的癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲能力均受到影響〔6～8〕。本研究結(jié)果證實(shí)了卵巢癌組織中MACC1的過(guò)度表達(dá)，這與之前的研究結(jié)果一致。

癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。癌細(xì)胞失控生長(zhǎng)后，逐漸破壞周圍組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥組織基底膜被破壞，癌細(xì)胞開(kāi)始進(jìn)入侵襲階段〔9〕。癌細(xì)胞能夠通過(guò)進(jìn)入淋巴管或者微血管進(jìn)入周圍組織中。癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力受到多種調(diào)控因子的共同作用〔10〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族的成員，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用〔11〕。有研究表明，MMP-2和MMP-9在肝癌、卵巢癌、舌鱗癌、胰腺癌等多種癌癥組織中表達(dá)異常升高，抑制MMP-2和MMP-9后的癌細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯降低〔12〕。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了干擾MACC1后的卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，結(jié)果提示，干擾MACC1后，卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲能力均受到抑制作用。這為進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)研究MACC1在卵巢癌中的作用奠定了基礎(chǔ)，為靶向MACC1基因治療卵巢癌提供了理論依據(jù)。

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