(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽 471023)
法氏囊(bursa of Fabricus,BF)是禽類B 細(xì)胞生長的最初發(fā)生位置,B 細(xì)胞生長成熟后由此轉(zhuǎn)移至周邊淋巴器官定居與增殖,實(shí)現(xiàn)免疫功能。法氏囊微環(huán)境里具備多種促使B 淋巴細(xì)胞生長的生物活性物質(zhì),近年來,法氏囊組織里陸續(xù)分離鑒定出多條活性肽,其中BP-I是從法氏囊組織中新分離的生物活性肽,其免疫學(xué)作用尚不清晰,本研究擬通過人工合成法氏囊生物活性肽BP-I和禽流感H9N2滅活疫苗配合運(yùn)用接種小鼠,通過測定小鼠體內(nèi)免疫指標(biāo)水平變化評價(jià)BP-I對禽流感H9N2滅活疫苗免疫佐劑特性,開拓了佐劑的研發(fā)領(lǐng)域。
28日齡BALB/c普通級老鼠80只購自河南鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,公母對半;禽流感疫苗(H9N2 亞型,SDS696株)購自乾元浩生物股份公司;禽流感病毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05(H9N2)和pET32a-HA(H9N2)質(zhì)粒,由本實(shí)驗(yàn)室保存。BP-I標(biāo)準(zhǔn)品由上??齐纳锟萍加邢薰竞铣?,純度>95%。HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG 抗體、TMB 底物、顯色液均購自鄭州鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司;小鼠細(xì)胞因子含量測定 ELISA 試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。
將80只28日齡BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組20只,分別是PBS組,單獨(dú)疫苗組、單獨(dú)疫苗+BP-I組和空白組,采取肌肉注射(i.m.)方式分別對各組小鼠(空白組除外)進(jìn)行兩次免疫,每次免疫間隔2周,即所有組分別于0、14d進(jìn)行首免和二免。
首免后7、21d分離小鼠血清,并采用ELISA方法檢測小鼠血清 H9N2 HA 抗體。
首免后7、21d對小鼠進(jìn)行采血,如圖2-2-d所示,并分離小鼠血清,采用小鼠細(xì)胞因子含量測定 ELISA 試劑盒檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量,具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。每次分析時(shí),使用對照的細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算血清中細(xì)胞因子的含量。
二免2周后(即首免后28d),經(jīng)口服途徑對各實(shí)驗(yàn)組小鼠(20只/組)攻擊H9N2型禽流感病毒毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05(H9N2)100 μL(2.5×106TCID50/0.1 mL),設(shè)空白對照組,攻毒后各組小鼠隔離飼養(yǎng)。于攻毒后第7d分別從各組隨機(jī)抽取5只小鼠分離其肺臟,制作肺臟的HE切片來分析病變情況。HE染色及切片的制備委托武漢谷歌生物有限公司完成。
于首免后7、21d分離小鼠血清進(jìn)行IgG 抗體檢測,結(jié)果如圖1所示,首免后7d和21d時(shí),疫苗+BP-I組和疫苗組小鼠血清中IgG抗體分泌水平均顯著高于PBS組(P<0.01),疫苗+BP-I組小鼠血清IgG抗體分泌水平顯著高于疫苗組(P<0.01),且首免后21d時(shí)較首免后7d時(shí)各組IgG抗體水平均進(jìn)一步提高。表明法氏囊活性肽BP-I 能顯著提高免疫H9N2型AIV疫苗后小鼠IgG抗體分泌水平。
圖1 免疫 小鼠血清IgG抗體平均水平
首免后7、21d分離小鼠血清,采用小鼠細(xì)胞因子含量測定ELISA 試劑盒檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量,以分析BP-I對H9N2型AIV疫苗免疫后小鼠的細(xì)胞免疫水平的影響。IL-4的分泌水平如圖2所示,7d與21d時(shí)均是:疫苗+BP-I組和疫苗組的細(xì)胞因子IL-4的分泌水平差異不顯著(P>0.05),疫苗組與PBS組的IL-4的分泌水平差異極顯著(P<0.01),疫苗+ BP-I組與PBS組的IL-4的分泌水平差異極顯著(P<0.01),表明法氏囊活性肽 BP-I對于提高免疫后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IL-4分泌水平作用不顯著。IFN-γ的水平變化如圖2所示,7d與21d時(shí)均是:疫苗+BP-I組和疫苗組小鼠血清中IFN-γ的分泌水平均顯著高于PBS組(P<0.01),疫苗+BP-I組小鼠血清中IFN-γ的分泌水平顯著高于疫苗組(P<0.01),且首免后21d時(shí)較首免后7d時(shí)各組IFN-γ的分泌水平均進(jìn)一步提高,表明法氏囊活性肽BP-I能夠提高免疫后小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平。
圖2 免疫后各組小鼠細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4水平變化
圖3 小鼠免疫后各組肝脾指數(shù)變化
小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)的變化如圖3所示,首免后7d和21d時(shí)均是:疫苗+BP-I組與疫苗組的肝指數(shù)差異不顯著(P>0.05);疫苗+BP-I組和疫苗組的脾指數(shù)差異不顯著(P>0.05)。說明法氏囊活性肽BP-I對免疫后小鼠的肝指數(shù)和脾指數(shù)變化的作用不顯著。
由于H9N2型禽流感病毒毒株A/chicken/Jiangsu/NJ07/05(H9N2)不能使小鼠出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和導(dǎo)致死亡,為有效評價(jià)各實(shí)驗(yàn)組小鼠免疫保護(hù)力的差異,于二免2周后,對小鼠攻擊A/chicken/Jiangsu/NJ07/05(H9N2)100 μL(2.5×106TCID50/0.1 mL),同時(shí)設(shè)空白對照組,在攻毒后7d從各組隨機(jī)抽取5只小鼠采集其肺臟,制作肺臟的HE切片,和正常肺臟相比,PBS組肺泡壁出血嚴(yán)重,肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)大量漿液和中性粒細(xì)胞;疫苗組與PBS組相比,肺泡壁出血減少、中性粒細(xì)胞減少;疫苗+BP-I組與疫苗組相比,肺泡壁出血明顯減少、中性粒細(xì)胞明顯減少。表明法氏囊活性肽BP-I配合疫苗能夠有效促進(jìn)小鼠肺臟中病毒的清除,從而對小鼠起到免疫保護(hù)的效果。
血清IgG抗體水平能夠反映被免疫動(dòng)物的體液免疫應(yīng)答能力,其檢測結(jié)果準(zhǔn)確性較高,并且檢測操作步驟比較簡便。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,法氏囊活性肽BP-I配合禽流感H9N2滅活疫苗,在兩次免疫后可以顯著增強(qiáng)小鼠血清中IgG抗體水平,提高機(jī)體的體液免疫水平,對特異性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)有著重大意義。細(xì)胞因子是一組在體內(nèi)免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞中產(chǎn)生的異質(zhì)性肽類調(diào)節(jié)因子。細(xì)胞因子具有廣泛的生物活性,對免疫應(yīng)答的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)具有重要作用,是評價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫狀況的一個(gè)重要的免疫指標(biāo)。細(xì)胞因子在體內(nèi)能激活和調(diào)節(jié)免疫活性細(xì)胞,IL-4和IFN-γ分別為Th2和Th1類免疫反應(yīng)的代表性細(xì)胞因子。試驗(yàn)結(jié)果顯示法氏囊活性肽BP-I配合禽流感H9N2滅活疫苗免疫小鼠能夠顯著提高IFN-γ的分泌水平,對IL-4的分泌水平影響不顯著,能夠提高機(jī)體細(xì)胞免疫水平。小鼠脾臟的變化情況能夠表現(xiàn)總體的免疫變化,肝臟也是重要的臟器,而且取材較方便。肝脾指數(shù)可以較好地反映出小鼠機(jī)體的免疫情況。本實(shí)驗(yàn)在首免后7d和21d時(shí)隨機(jī)取小鼠的肝、脾并稱重,并計(jì)算肝脾指數(shù)。結(jié)果表明:疫苗+ BP-I組的肝指數(shù)和疫苗組差異不顯著;疫苗+ BP-I組的脾指數(shù)和疫苗組差異不顯著。說明法氏囊活性肽BP-I與疫苗配合使用對小鼠肝臟和脾臟指數(shù)變化影響不大。本試驗(yàn)在二免2周后對小鼠進(jìn)行動(dòng)物免疫保護(hù)試驗(yàn)。由于選用的 H9N2亞型禽流感病毒毒株 A/chicken/Jiangsu/NJ07/05(H9N2)不能使小鼠出現(xiàn)明顯的流感臨床癥狀和導(dǎo)致死亡,而且以2.5×106TCID50的劑量感染小鼠后該病毒主要分布在其肝臟、脾臟和肺臟,其中肺臟中的帶毒量最多。因此,為有效評價(jià)BP-I的佐劑特性,我們只做了HE切片,結(jié)果顯示,攻毒后7d時(shí)疫苗+BP-I 組幾乎觀察不到小鼠肺臟的病變。表明BP-I 配合疫苗使用能夠抑制AIV 在小鼠肺臟中的復(fù)制。
法氏囊活性肽BP-I配合疫苗使用能顯著提高小鼠血清中IgG抗體的分泌水平。能顯著提高小鼠血清內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ的分泌水平,對IL-4的分泌水平影響不大。對小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)變化的作用不顯著。法氏囊活性肽BP-I配合疫苗使用會(huì)增強(qiáng)對小鼠肺臟的免疫保護(hù)作用。
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