HIF—1α與TLR4在鼻息肉組織中的表達(dá)及相互關(guān)系

崔粲+任金龍+王銀霞

【摘要】 目的：檢測(cè)HIF-1α、TLR4在鼻息肉組織中的表達(dá)及相關(guān)性，探討其在鼻息肉發(fā)病機(jī)制中可能的作用。方法：選取30例經(jīng)鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療的鼻息肉患者的鼻息肉組織為試驗(yàn)組，及同期30例經(jīng)鼻中隔偏曲矯正術(shù)治療的患者的下鼻甲黏膜為對(duì)照組。采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)兩組標(biāo)本中HIF-1α、TLR4的表達(dá)情況。結(jié)果：試驗(yàn)組HIF-1α、TLR4表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；經(jīng)Pearson相關(guān)性分析得出，試驗(yàn)組中HIF-1α、TLR4表達(dá)呈顯著正相關(guān)性（r=0.907，P<0.01）。結(jié)論：HIF-1α、TLR4在鼻息肉組織中表達(dá)水平上調(diào)并且呈顯著正相關(guān)性，提示鼻息肉發(fā)生過程中組織缺氧、感染存在，HIF-1α、TLR4可能通過某種機(jī)制相互促進(jìn)，共同導(dǎo)致鼻息肉的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】 鼻息肉； HIF-1α； TLR4

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and correlation of HIF-1α and TLR4 in nasal polyps，and to discuss the possible role of them in the pathogenesis of nasal polyps. Method：The nasal polyps of 30 patients with nasal polyps treated by nasal endoscopic surgery were selected as the experimental group，the same period，the inferior turbinate mucosa of 30 patients with nasal septum surgery were selected as the control group.Immunohistochemical staining technique was used to detect the expression of HIF-1α and TLR4 in two groups of specimens.Result：The expression levels of HIF-1αand TLR4 in the experimental group were significantly higher than those in the control group，and the differences were statistically significant（P<0.01）.Pearson correlation analysis showed that there was a significant positive correlation between the expression of HIF-1αand TLR4 in the experimental group（r=0.907，P<0.01）.Conclusion：The levels of HIF-1α and TLR4 in nasal polyps are up-regulated and positively correlated，it suggests that tissue hypoxia and infection exist during nasal polyps，HIF-1αand TLR4 may promote each other through some mechanism，which can lead to nasal polyps.

【Key words】 Nasal polyp； HIF-1α； TLR4

First-authors address：Graduate School of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.02.001

鼻息肉是鼻腔及鼻竇黏膜的慢性炎癥性疾病，致病因素目前不清楚，考慮是許多誘因綜合作用的結(jié)果，其組織學(xué)特征為組織間隙水腫，嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，基質(zhì)中有散在、不成熟的血管交錯(cuò)，缺乏正常神經(jīng)支配及細(xì)胞連接[1]。近年來研究表明鼻腔、鼻竇黏膜組織的缺氧及感染可能促進(jìn)了鼻息肉的形成及發(fā)展，而HIF-1α、TLR4在組織中異常表達(dá)或許起主導(dǎo)作用[2-4]。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩亞基聚合而成，負(fù)責(zé)調(diào)控低氧環(huán)境中組織細(xì)胞增殖、代謝及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而HIF-1α為HIF-1表達(dá)水平、活性及穩(wěn)定性調(diào)控亞基[5]。TLR4受體為天然免疫模式識(shí)別受體，是Toll樣受體的主要組成部分，主要通過識(shí)別病原微生物的細(xì)胞壁成分激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，發(fā)揮免疫防御及免疫調(diào)節(jié)等作用[6]。本試驗(yàn)旨在運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)上述兩因子在鼻息肉中的表達(dá)情況，進(jìn)一步明確HIF-1α、TLR4在鼻息肉發(fā)生中的作用及可能的內(nèi)在關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 鼻息肉組織來源于2016年

3月-2017年3月在山西醫(yī)科大學(xué)附屬汾陽醫(yī)院耳鼻咽喉科行鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療的30例鼻息肉住院患者列為試驗(yàn)組，選取同期30例行鼻中隔偏曲矯正下鼻甲部分切除術(shù)治療的鼻中隔偏曲住院患者的下鼻甲黏膜組織為對(duì)照組。試驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患者癥狀、體征及輔助檢查診斷為鼻息肉并且術(shù)后經(jīng)病理證實(shí)。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)患者癥狀、體征、輔助檢查診斷明確且需手術(shù)治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均可排除變應(yīng)性鼻炎、支氣管哮喘、阿司匹林三聯(lián)征、囊性纖維化等疾病，并且術(shù)前2周內(nèi)均未使用過糖皮質(zhì)激素、抗組胺類藥物，未患過流行性感冒等病毒性疾病及上呼吸道感染。標(biāo)本取材經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并告知患者經(jīng)得患者同意且術(shù)前簽知情同意書。試驗(yàn)標(biāo)本均取材于術(shù)中，endprint

-78 ℃冰箱保存，10%中性福爾馬林溶液固定，然后進(jìn)行石蠟包埋，制成石蠟塊儲(chǔ)存。

1.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色SABC法。石蠟塊經(jīng)切片機(jī)連續(xù)3 μm切片制成石蠟切片，經(jīng)烤片機(jī)60 ℃烘烤0.5 h使切片緊密黏附。切片脫蠟至水，抗原熱修復(fù)。加入5%BSA封閉液37 ℃孵育30 min甩干。分別滴加一抗小鼠抗人HIF-1α、TLR4單克隆抗體（sc-13515，sc-293072購于美國Santa Cruz公司），工作濃度為1∶50，4 ℃過夜。滴加二抗生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（購于武漢博士德SA1021-小鼠IgG即用型免疫組化染色試劑盒），37 ℃孵育30 min。PBS沖洗5 min×3次。滴加SABC，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×3次。滴加DAB，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，然后自來水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染2 min，放入鹽酸酒精分化液中分化數(shù)秒。脫水、透明、封片。PBS代替上述一抗做陰性對(duì)照。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 HIF-1α以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃染色為陽性細(xì)胞，TLR4以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃染色為陽性細(xì)胞。使用美國aperio公司Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)，每張組織切片于400倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重疊的陽性區(qū)域，統(tǒng)一測(cè)量窗下，讀取鎖定區(qū)域的灰度值，取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析研究指標(biāo)間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基線資料比較 試驗(yàn)組30例患者，其中男17例，女13例，年齡22～70歲，平均（43.3±5.2）歲；對(duì)照組30例患者，其中男19例，女11例，年齡27～68歲，平均（42.5±4.3）歲。兩組患者一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

2.2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果 HIF-1α在鼻息肉組織主要表達(dá)于上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞、部分炎性細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，染色呈棕黃色；在下鼻甲黏膜組織僅表達(dá)于部分上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)，染色黃色至棕黃色不等。TLR4在鼻息肉組織主要表達(dá)于上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞、固有層炎性細(xì)胞細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中，染色呈棕黃色；在下鼻甲黏膜組織表達(dá)于上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞及部分炎性細(xì)胞細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中，染色黃色至棕黃色不等。見圖1～4。

2.3 兩組HIF-1α、TLR4灰度值比較 試驗(yàn)組HIF-1α、TLR4灰度值均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。采用Pearson相關(guān)性分析，試驗(yàn)組中HIF-1α、TLR4表達(dá)呈顯著正相關(guān)性（r=0.907，P<0.01），見圖5。

3 討論

HIF-1由Semenza等[7]于1992年在缺氧環(huán)境培養(yǎng)下細(xì)胞的核提取物中首次發(fā)現(xiàn)，隨后不久其分子結(jié)構(gòu)鑒定為異源二聚體，由分子量120 kD的HIF-1α和91/93/94 kD的HIF-1β兩個(gè)亞單位組成。HIF-1α與HIF-1β均為基本的螺旋-環(huán)-螺旋（basic-helix-loop-helix，bHLH）轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，具有Per-AHR/ARNT-Sim（PAS）結(jié)構(gòu)域。HIF-1α是保證缺氧誘導(dǎo)蛋白HIF-1穩(wěn)定性、決定表達(dá)水平、維持生物活性所必需的亞基，具有低氧依賴性，而HIF-1β僅僅起到結(jié)構(gòu)性作用并且表達(dá)水平穩(wěn)定[8]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)缺氧信號(hào)時(shí)，HIF-1α分解受抑制，HIF-1生物活性增強(qiáng)。HIF-1α與HIF-1β聚合成大量HIF-1分子，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子協(xié)調(diào)作用，調(diào)節(jié)缺氧相關(guān)基因及靶向基因的表達(dá)，使細(xì)胞適應(yīng)缺氧，并維持代謝、增殖、誘發(fā)炎癥反應(yīng)等。近年來發(fā)現(xiàn)鼻息肉患者常常合并竇口-鼻道復(fù)合體解剖學(xué)結(jié)構(gòu)異常，如中鼻道狹窄、鼻甲肥大、竇口堵塞，并且息肉往往起源于中鼻道及鼻竇腔。Tos等[9]認(rèn)為中鼻道的血流量較其他部位低，息肉組織中血流量更低，缺氧環(huán)境可能是鼻息肉發(fā)生的孵育器。與缺氧環(huán)境關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子是HIF-1α，Chien等[10]通過RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色來檢測(cè)鼻息肉組織和正常下鼻甲黏膜中的HIF-1α表達(dá)情況，推測(cè)出HIF-1α高水平表達(dá)可加重炎癥反應(yīng)及組織水腫、細(xì)胞缺氧損傷并導(dǎo)致鼻息肉形成。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)組織處于缺氧環(huán)境下，HIF-1α也可通過PI3K/Akt通路的激活來提高表達(dá)水平同時(shí)促進(jìn)一氧化氮合酶的生成，使下游靶基因產(chǎn)物VEGF表達(dá)增多，從而誘發(fā)組織水腫及趨化炎性細(xì)胞浸潤[11-15]。楊琳紅[16]通過建立無血清原代人鼻黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系及低氧體系，運(yùn)用原位雜交及Western Blot對(duì)HIF-1α及其靶向產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，肯定了HIF-1α對(duì)鼻息肉發(fā)生、發(fā)展中的意義。在本項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α蛋白表達(dá)水平在試驗(yàn)組較健康對(duì)照組升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示HIF-1α在鼻息肉發(fā)生發(fā)展中有著重要的促進(jìn)作用。再次證實(shí)了鼻息肉組織中缺氧環(huán)境的存在，HIF-1α的過表達(dá)促進(jìn)了鼻息肉的產(chǎn)生。

TLR4是固有免疫防御體系中重要的模式識(shí)別受體，其配體主要為人體致病微生物細(xì)胞壁成分，表達(dá)在免疫組織及細(xì)胞表面[17]。屬于經(jīng)典Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)組成。胞外區(qū)由富亮氨酸的氨基酸重復(fù)序列構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域呈馬蹄狀，與配體結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)?？缒^(qū)及胞質(zhì)區(qū)主要發(fā)揮信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。當(dāng)受體與配體結(jié)合后，可激活MyD88信號(hào)通路，分泌各種細(xì)胞因子、啟動(dòng)免疫細(xì)胞應(yīng)答、誘發(fā)炎癥反應(yīng)以消滅入侵致病微生物。同時(shí)在TLR4信號(hào)通路下游有NF-κB因子，主要介導(dǎo)免疫因子及炎性因子的表達(dá)調(diào)節(jié)，有研究發(fā)現(xiàn)其與炎癥瀑布效應(yīng)及免疫失控自身損傷關(guān)系密切[18]。大量資料顯示鼻息肉患者鼻腔分泌物及術(shù)中黏膜取樣G-細(xì)菌、真菌等病原體檢出率較高。王成碩等[4]首次使用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)TLR4mRNA在鼻息肉組織中表達(dá)較高與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，論證鼻息肉發(fā)病過程感染因素的存在。病原體感染可導(dǎo)致鼻息肉發(fā)病已是不爭的事實(shí)。國外用特殊感染病原體誘發(fā)呼吸道上皮細(xì)胞TLR4高表達(dá)，呼吸道炎癥反應(yīng)明顯、細(xì)胞損傷較重，抑制TLR4表達(dá)后減輕了上皮細(xì)胞損傷，認(rèn)為TLR4異常表達(dá)對(duì)機(jī)體不利[19]。顧兆偉等[20]采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)鼻息肉組織中TLR4蛋白表達(dá)，TLR4 表達(dá)水平與炎癥、病變程度大致呈正相關(guān)，提示TLR4高表達(dá)可能與鼻息肉形成有關(guān)。Cho等[21]證實(shí)細(xì)菌細(xì)胞壁脂多糖可通過TLR4觸發(fā)免疫應(yīng)答激活MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路參與鼻息肉組織的重塑，進(jìn)一步論證TLR4的異常表達(dá)可參與鼻息肉的形成。本研究中TLR4在試驗(yàn)組表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.01），鏡下可見鼻息肉組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤、組織水腫嚴(yán)重與先前研究結(jié)果基本保持一致，可以推測(cè)出雖然TLR4作為機(jī)體固有免疫防線，但是在表達(dá)高度上調(diào)發(fā)揮免疫防御角色時(shí)，也誘發(fā)了鼻黏膜持續(xù)炎癥反應(yīng)及損傷，最終可誘發(fā)鼻息肉形成。endprint

HIF-1α與TLR4在鼻黏膜息肉病變發(fā)生機(jī)制上的研究仍尚不明朗。筆者采用Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)鼻息肉組織中HIF-1α、TLR4表達(dá)呈高度正相關(guān)性（r=0.907，P<0.01）。之前有研究證實(shí)當(dāng)抑制鼻息肉組織TLR4表達(dá)后，HIF-1α的靶向產(chǎn)物表達(dá)受抑制[22]。結(jié)合本次研究結(jié)果可以推測(cè)出HIF-1α與TLR4之間可能存在交叉對(duì)話，它們共同促進(jìn)了鼻息肉的形成與發(fā)展，但具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究證明。

參考文獻(xiàn)

[1] Larsen P L，Tos M.Nasal polyps：epithelium and goblet cell density[J].Laryngoscope，1989，99（12）：1274-1280.

[2] Shin H W，Cho K，Kim D W，et al.Hypoxia-inducible Factor 1 Mediates Nasal Polypogenesis by Inducing Epithelial-to-Mesenchymal Transition[J].Am J Respir Crit Care Med，2012，185（9）：944-954.

[3] Bachert C，Zele T，Gevaert P，et al.Super antigens and nasal polyps[J].Curr Allergy Asthma Rep，2003，3（6）：523-531.

[4]王成碩，董震，楊占泉.Toll樣受體mRNA在鼻息肉中的表達(dá)及意義[J].中國耳鼻咽喉頭頸外科，2004，11（3）：185-187.

[5] Bracken C P，Whitelaw M L，Peet D J.The hypoxia-inducible factors：key transcriptional regulators of hypoxic responses[J].Cell Mol Life Sci，2003，60：1376-1393.

[6] Moynagh PN.Toll-like receptor signalling pathways as key targets for mediating the anti-inflammatory and immunosuppressive effects of glucocorticoids[J].J En docrinol，2003，179（2）：139-144.

[7] Semenza G L，Agani F，Booth G，et al.Structural and functional analysis of hypoxia-inducible factor 1[J].Kidney Int，1997，51（2）：553-555.

[8] Wang G L，Jiang B H，Rue E A，et al.Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O tension[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（12）：5510-5514.

[9] Tos M，Sasaki Y，Ohnishi M，et al.Pathogenesis of nasal polyps[J].Rhinol Suppl，1992，14：181-185.

[10] Chien C Y，Tai C F，Ho K Y，et al.Expression of hypoxia-inducible factor 1 in the nasal polyps by real-time RT-PCR and immunohistochemistry[J].Otolaryngology-Head and Neck Surgery，2008，139（2）：206-210.

[11] Filippi I，Morena E，Aldinucci C，et al.Short-term hypoxia enhances the migratory capability of dendritic cell through HIF-1α

and PI3K/Akt pathway[J].J Cell Physiol，2014，229（12）：2067-2076.

[12] Zheng Z，Li Z，Chen S，et al.Tetramethylpyrazine attenuates TNF-α-induced iNOS expression in human endothelial cells：Involvement of Syk-mediated activation of PI3K-IKK-IκB signaling pathways[J].Exp Cell Res，2013，319（14）：2145-2151.

[13] Chern C M，Liou K T，Wang Y H，et al.Andrographolide inhibits PI3K/AKT-dependent NOX2 and iNOS expression protecting mice against hypoxia/ischemia-induced oxidative brain injury[J].Planta Med，2011，77（15）：1669-1679.

[14] Jeon W Y，Shin I S，Shin H K，et al.Samsoeum water extract attenuates allergic airway inflammation via modulation of Th1/Th2 cytokines and decrease of iNOS expression in asthmatic mice[J].BMC Complement Altern Med，2015，15（1）：47.endprint

[15] Iyer A K，Ramesh V，Castro C A，et al.Nitric oxide mediates bleomycin-induced angiogenesis and pulmonary fibrosis via regulations of VEGF[J].J Cell Biochem，2015，116（11）：2484-2493.

[16]楊琳紅.人鼻黏膜上皮細(xì)胞HIF-1α和VEGF的表達(dá)及意義[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科，2008，22（8）：341-345.

[17] Kokkinopoulos J，Jondan W J，Ritter M A.Toll-like receptor mRNA expression patterns in human dedritic cells and noncytes[J].Mol Immunol，2005，42（8）：957-963.

[18] Coimbra R，Melbostad H，Loomis W，et al.LPS-induced acute lung injury is attenuated by phosphodiesterase inhibition：effects on proinflammatory mediators metalloproteinases NF-κB and ICAM-1 expression[J].Trauma，2006，60（1）：115-125.

[19] Regueiro V，Moranta D，Campos M A，et al.Klebsiella pneumonia increase the levels of toll-like receptors 2 and 4 in human airway epithelial cells[J].Infect Immun，2009，77（2）：714-724.

[20]顧兆偉，曹志偉，王韞秀.TLR-2和TLR-4在慢性鼻竇炎鼻息肉中的表達(dá)及臨床意義[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2013，19（1）：43-47.

[21] Cho J S，Kang J H，Um J Y，et al.Lipopolysaccharide Induces Pro-Inflammatory Cytokines and MMP Production via TLR4 in Nasal Polyp-Derived Fibroblast and Organ Culture[J].PLoS One，2014，9（11）：e90683.

[22] Cho J S.Steroids inhibit vascular endothelial growth factor expression via TLR4/Akt/NF-κB pathway in chronic rhinosinusitis with nasal polyp[J].Experimental Biology and Medicine，2014，239（8）：913-921.

（收稿日期：2017-09-25） （本文編輯：程旭然）endprint