大孔樹脂分離純化沙棗總黃酮的工藝

蘭蓉　劉卉　李浡

摘要：為了確定大孔樹脂分離和純化沙棗總黃酮的工藝條件，以大孔樹脂靜態(tài)吸附量和解吸率為指標，在7種大孔樹脂中篩選出分離沙棗總黃酮的最佳大孔樹脂型號，采用單因素試驗優(yōu)化這種大孔樹脂的吸附、洗脫條件。結果表明，在7種大孔樹脂中，XAD7HP型樹脂純化沙棗總黃酮的性能最好，其最佳分離、純化工藝條件如下：樣品質(zhì)量濃度0.05 mg/mL，上樣pH值為4，上樣流速為0.5 mL/min，最大上樣量為30 mL，洗脫液為60%乙醇，洗脫流速為 0.5 mL/min，最大洗脫體積為40 mL。在所確定的工藝條件下，XAD7HP型大孔樹脂能較好地用于沙棗總黃酮的分離純化，總黃酮的純度由原來的15.24%提高到了48.77%。

關鍵詞：沙棗；總黃酮；大孔樹脂；分離純化

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0160-04

沙棗（Elaeagnus Angustifolia L.），別稱桂香柳、七里香等，為胡頹子科胡頹子屬植物，在我國新疆、青海和寧夏等西北省（區(qū)）的栽培面積達13萬hm2以上[1]，是民間治療嘔吐和胃脹的傳統(tǒng)藥方，多用于脾胃虛弱、消化不良、腸炎腹瀉、肺熱咳嗽等疾病的治療[2]。據(jù)報道，沙棗果實富含黃酮、鞣質(zhì)、齊墩果酸等功能性成分和營養(yǎng)成分，具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腹瀉和抗疲勞等多種藥物用途和營養(yǎng)價值，是西北地區(qū)具有開發(fā)利用前景的重要資源[3-9]。

近年來，國內(nèi)外科研工作者對沙棗中的主要功能性成分——黃酮開展了一些研究工作。比如Si等從沙棗樹皮中分離得到了兒茶素、表兒茶酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、槲皮素和毛地黃黃酮等黃酮類化合物[10]。王基云等研究發(fā)現(xiàn)，沙棗花醇提物的總黃酮含量為27 mg/g，能夠抑制自由基誘導的肝臟脂質(zhì)過氧化損傷作用[11]。但是目前仍未有沙棗果黃酮分離純化的研究報道，所以本試驗通過比較7種不同型號的大孔吸附樹脂對沙棗果總黃酮吸附性能的差異，探討分離純化沙棗果總黃酮的工藝條件，以期為沙棗這一特色資源的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器與設備

SHA-C型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；玻璃柱（Ф 1 cm×30 cm，上海琪特分析有限公司）；BT300-2J/YZⅡ25型恒流泵（保定蘭格恒流泵有限公司）；SHB-Ⅳ型雙循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；AR2140型電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Heidolph）；UV-1800PC-DSLL型紫外-可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；PHS-3C型酸度計（上海楚柏儀器有限公司）。

1.2材料與試劑

試驗材料：沙棗，購自新疆哈密瓜鄉(xiāng)果業(yè)股份有限公司。試驗試劑：D101型大孔樹脂（國藥集團化學試劑有限公司）；XAD7HP型大孔樹脂（美國羅門哈斯公司）；NKA-2、X-5、NKA-9型大孔樹脂（鄭州勤實科技有限公司）；HPD100B、AB-8型樹脂（河北滄州寶恩化工有限公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗方法

1.3.1大孔樹脂的預處理大孔樹脂用體積分數(shù)95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后，濕法裝柱，再用體積分數(shù)95%乙醇淋洗至流出液與水混合液（體積比1 ∶5）不呈白色為止，然后用大量純凈水洗盡乙醇（無醇味），備用。

1.3.2樣品制備[12]取粉碎后的沙棗，加入20倍（質(zhì)量體積比）的85%乙醇常溫浸泡24 h后過濾、減壓濃縮、60 ℃干燥，制得干燥浸膏樣品。精確稱取干燥浸膏2 g，加90 mL水超聲處理，使其充分溶解后，將溶液定容至100 mL量瓶中，作為備用液。

1.3.3黃酮含量的測定

1.3.3.1黃酮標準曲線的制備稱取蕓香苷10.0 mg，用60%乙醇完全溶解，在50 mL容量瓶中定容，得到0.2 mg/mL蕓香苷對照品溶液。

精確吸取蕓香苷對照品0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL容量瓶中，補加蒸餾水使所有容量瓶內(nèi)液體都在相同刻度線，加1 mL 5% NaNO2，室溫放置6 min；加1 mL 10% Al（NO3）3，室溫放置6 min；加1 mol/L NaOH 10 mL，用60%乙醇定容至25.00 mL，搖勻后放置15 min，在波長 505 nm 處測各溶液的吸光度。以吸光度（ρ）為縱坐標、濃度（C）為橫坐標制作工作曲線，結果得到標準方程為ρ=0.086 9C-0000 6，r2=0.999 9。

1.3.3.2樣品黃酮含量的測定稱取固體樣品100 mg，加入 HCl-乙醇（體積比1 ∶25，HCl、乙醇濃度分別為1%、70%）定容到10.0 mL，超聲15 min，取2.0 mL上清液，加 1 mL 5% NaNO2，室溫放置6 min；加1 mL 10% Al（NO3）3，室溫放置 6 min，加1 mol/L NaOH 10 mL，用60%乙醇定容至25.00 mL，在波長505 nm處測吸光度。

1.3.4樹脂的篩選

1.3.4.1樹脂含水量的測定稱取2 g預處理后抽干水分的大孔樹脂，置于80 ℃的干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，根據(jù)樹脂的濕質(zhì)量和干質(zhì)量，用公式Y=（1-m1/m0）×100%計算樹脂的含水量。其中：Y為樹脂的含水量，%；m1為干樹脂的質(zhì)量，g；m0為濕樹脂的質(zhì)量，g。

1.3.4.2各種樹脂靜態(tài)吸附量和解吸率的測定準確稱取5 g各種型號濕樹脂（用濾紙吸干表面水分），置于100 mL三角錐形瓶中，加入30 mL配制好的沙棗總黃酮水溶液，在 30 ℃ 下以100 r/min的轉(zhuǎn)速在恒溫搖床中振蕩2 h，過濾后取樣品，通過紫外-可見分光光度法測定過濾液濃度，用以下公式可以計算樹脂的靜態(tài)飽和吸附量、吸附率：endprint

式中：P0為樣品液中總黃酮的初始濃度，mg/mL；Pa為吸附平衡后溶液中總黃酮的濃度，mg/mL；Va為樣品液體積，mL；m為濕樹脂質(zhì)量，g；Y為樹脂的含水量，%。

取上述經(jīng)靜態(tài)飽和吸附總黃酮后濾出的樹脂，用純凈水沖洗10 min后，用濾紙吸干表面水分，置于錐形瓶中，分別精確加入50 mL體積分數(shù)95%的乙醇，用搖床持續(xù)振蕩5 h后，分別測定洗脫液中總黃酮濃度，按下式計算各型號樹脂的解吸率：解吸率=[洗脫液濃度×洗脫液體積]/[（P0-Pa）×Va]×100%。

1.3.5大孔樹脂分離純化沙棗總黃酮的工藝優(yōu)化

1.3.5.1最佳上樣濃度的確定精確稱取5.0 g抽干水分的優(yōu)選樹脂，各7份，分別加入30 mL不同質(zhì)量濃度的沙棗黃酮粗提液，在30 ℃下以100 r/min的轉(zhuǎn)速在恒溫搖床中振蕩2 h，過濾，測定濾液中黃酮含量，計算吸附率。

1.3.5.2最佳上樣pH值的確定精確稱取5.0 g抽干水分的優(yōu)選樹脂，各5份，分別加入30 mL質(zhì)量濃度為 0.05 mg/mL，pH值為2、4、6、8、10的沙棗黃酮粗提液，在 30 ℃ 下以100 r/min的轉(zhuǎn)速在恒溫搖床中振蕩2 h，過濾，測定濾液中黃酮含量，計算吸附率。

1.3.5.3最佳上樣流速的確定選用1 cm×30 cm玻璃柱，用優(yōu)選后的樹脂濕法裝柱，按徑高比1 ∶10裝柱。分別取 10 mL 質(zhì)量濃度0.05 mg/mL、pH值為4的沙棗黃酮粗提液，分別以0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min流速上樣，然后用蒸餾水洗脫至流出液接近無色，分別收集流出殘余液、水洗液，繼而用70%乙醇進行洗脫，收集流出液至無色，測定各個收集液中的黃酮含量，并計算吸附率。

1.3.5.4最佳洗脫液濃度的確定精確稱取5.0 g抽干水分的優(yōu)選樹脂，各5份，分別加入30 mL質(zhì)量濃度為 0.05 mg/mL、pH值為4的沙棗黃酮粗提液，在30 ℃下以 100 r/min 的轉(zhuǎn)速在恒溫搖床中振蕩2 h，過濾，過濾后收集吸附殘液，測定Pa，繼續(xù)用蒸餾水洗脫至流出液接近無色，收集水洗液，然后分別用50 mL 30%、45%、60%、75%、95%乙醇溶液洗脫吸附飽和樹脂，用搖床持續(xù)振蕩5 h后，分別測定洗脫液中總黃酮濃度，計算解吸率，篩選最佳洗脫液濃度。

1.3.5.5最佳洗脫流速的確定參照“1.3.5.3”節(jié)方法制備沙棗黃酮粗提液，以0.5 mL/min流速上樣，待吸附完全后，先用純凈水洗去未吸附部分至水洗流出液無色后，再用60%乙醇分別以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min的流速洗脫，收集洗脫液，測定洗脫液中總黃酮含量，計算各條件下的解吸率。

1.3.5.6泄漏曲線制備按“1.3.5.5”節(jié)上樣、沖洗后，再用60%乙醇以0.5 mL/min流速洗脫、分段收集流出液，每 5 mL 收集1次，測定收集液中黃酮含量，繪制泄漏曲線。

1.3.5.7洗脫曲線制備根據(jù)泄漏曲線試驗結果，取30 mL質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL、pH值為4的沙棗黃酮粗提液，以 0.5 mL/min 流速通過層析柱，吸附飽和后，先用蒸餾水洗去樹脂表面的糖類及雜質(zhì)，直至流出液為無色后，再用60%乙醇以0.5 mL/min流速洗脫，每5 mL收集1次，測定洗脫液黃酮含量，繪制洗脫曲線。

1.3.5.8工藝驗證試驗根據(jù)上述試驗結果，確定沙棗總黃酮最佳純化工藝條件，按此條件平行做3次試驗，分別計算得率和純度，相關公式：

黃酮得率=洗脫液中總黃酮質(zhì)量/上樣液中總黃酮質(zhì)量×100%；

黃酮純度=洗脫液中總黃酮質(zhì)量/洗脫液中總固形物質(zhì)量×100%。

2結果與分析

2.1樹脂的篩選結果

由表1可知，XAD7HP、X-5型大孔樹脂的吸附能力較強，其中XAD7HP型樹脂吸附量最大，而且解吸率比X-5高18.06%。經(jīng)比較，確定選用XAD7HP型大孔樹脂。

2.2大孔樹脂分離純化沙棗總黃酮的工藝優(yōu)化結果

2.2.1最佳上樣濃度的確定由圖1可以看出，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，樹脂吸附率先上升然后下降并趨于平緩，當樣品質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時，樹脂吸附率達到最大值 84.86%。黃酮溶液濃度是影響樹脂吸附性能的重要因素之一，樣品質(zhì)量濃度增加，則其黏度增大，黃酮向樹脂內(nèi)部傳質(zhì)速度慢，使得有些黃酮沒有及時被吸附就流出來；此外，樣品濃度增加，競爭性吸附的雜質(zhì)也在增加，這些雜質(zhì)的存在減少了有效吸附面積，導致樹脂吸附率下降。從圖1還可看出，提高樣品質(zhì)量濃度有利于提高樹脂的吸附效果，但是樣品質(zhì)量濃度過高的話，反而會降低樹脂吸附率，因此用XAD7HP樹脂吸附沙棗黃酮時，樣品質(zhì)量濃度以0.05 mg/mL左右為宜。

2.2.2最佳上樣pH值的確定從圖2可以看出，樣品液pH值為4時，XAD7HP樹脂的吸附率最高；當pH值>4時，隨著pH值升高，XAD7HP樹脂的吸附率下降。原因可能是pH值是影響大孔樹脂吸附能力的因素之一，一般來說，酸性化合物在酸性介質(zhì)中的吸附較充分。黃酮類化合物具有酚羥基，顯弱酸性，在酸性條件下吸附較好，但是本試驗中樣品液pH值為2時吸附率不升反降，可能是酸性太強，樣品液中的黃酮類化合物轉(zhuǎn)變?yōu)檠瘥}而溶解，因而不易被吸附[13]。所以，本試驗選擇pH值為4的沙棗黃酮粗提液上樣。

2.2.3最佳上樣流速的確定表2結果表明，隨著上樣流速的增大，XAD7HP型大孔樹脂的吸附率下降。原因可能是減慢流速能使待分離物質(zhì)和樹脂充分接觸，有利于吸附；但是，流速太慢容易造成死吸附且費時，故根據(jù)試驗結果，選擇上樣流速為0.5 mL/min。

2.2.4最佳洗脫液濃度的確定由表3可知，隨著乙醇體積分數(shù)的不斷加大，沙棗總黃酮的解吸率先表現(xiàn)為不斷上升；但當體積分數(shù)≥75%時，解吸率反而有所下降?？赡茉蚴怯捎谝掖俭w積分數(shù)的升高會增加醇溶性雜質(zhì)含量，使得沙棗總黃酮在洗脫液中的溶解度減小，從而造成了解吸率的先升后降。因此，本試驗選擇60%乙醇作為洗脫劑較為適宜。endprint

2.2.5最佳洗脫流速的確定從圖3可以看出，隨洗脫流速的加快，沙棗總黃酮的解吸率整體呈下降趨勢。對于一定量的洗脫劑而言，加快洗脫流速，會使洗脫劑中的溶質(zhì)分子與大孔樹脂的作用時間縮短，溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂的內(nèi)表面將黃酮徹底洗脫下來，從而使解吸率下降；但流速過慢時，又會導致操作時間過長，降低生產(chǎn)效率。因此本研究選擇洗脫流速為0.5 mL/min。

2.2.6泄漏曲線圖4結果表明，沙棗總黃酮在第6份流出液處未吸附率（即洗脫液黃酮濃度）明顯增大，之后變化趨于平緩，說明樹脂柱在第6份流出液處出現(xiàn)泄漏拐點。為最大程度地吸附沙棗總黃酮，同時又節(jié)約料液、提高生產(chǎn)效率，設定第6份處為泄漏點，據(jù)此確定30 mL作為最大上樣量。

[TPLR44.tif]

2.2.7洗脫曲線由圖5可以看出，XAD7HP型樹脂的洗脫峰窄而尖銳，被解吸的黃酮主要集中在10～30 mL體積范圍內(nèi)。從第8份流出液開始，總黃酮濃度幾乎沒有變化，說明樹脂柱基本被洗脫干凈。為了節(jié)約洗脫劑，縮短生產(chǎn)周期，確定40 mL作為最大洗脫體積。

[TPLR55.tif；S+2mm]

2.2.8工藝驗證結果在最佳工藝條件下，沙棗料液中總黃酮的得率分別為76.42%、78.17%、79.54%，平均得率為 78.04%；總黃酮的純度由原來的15.24%提高到48.77%。

3結論與討論

在1 cm×30 cm玻璃柱中，按徑高比1 ∶10濕法裝柱，考察了7種不同型號大孔樹脂對沙棗總黃酮的靜態(tài)吸附及解吸性能，由于XAD7HP型大孔樹脂對沙棗總黃酮有較高吸附量和解吸率，故選用XAD7HP型樹脂進一步優(yōu)化沙棗總黃酮的分離純化參數(shù)。綜合各項試驗結果可以確定：采用30 mL質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL、pH值為4的沙棗黃酮粗提液以 0.5 mL/min 流速上樣，完全吸附后用蒸餾水洗脫至流出液接近無色，繼而用40 mL、60%乙醇以0.5 mL/min速度進行洗脫，可達到XAD7HP型樹脂對沙棗總黃酮分離純化的最佳效果，總黃酮的純度由原來的15.24%提高到了48.77%，試驗結果比較理想。筆者所在課題組將在此試驗結果的基礎上，繼續(xù)深入研究沙棗中的黃酮類化合物成分，采用先進分離純化手段，以期得到高純度的沙棗黃酮單體，并研究其體外抗氧化活性，為更好地開發(fā)利用沙棗這種中藥提供更多科學依據(jù)。

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