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    大孔樹脂分離純化沙棗總黃酮的工藝

    2018-02-06 07:33蘭蓉劉卉李浡
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2017年15期
    關鍵詞:分離純化沙棗總黃酮

    蘭蓉 劉卉 李浡

    摘要:為了確定大孔樹脂分離和純化沙棗總黃酮的工藝條件,以大孔樹脂靜態(tài)吸附量和解吸率為指標,在7種大孔樹脂中篩選出分離沙棗總黃酮的最佳大孔樹脂型號,采用單因素試驗優(yōu)化這種大孔樹脂的吸附、洗脫條件。結果表明,在7種大孔樹脂中,XAD7HP型樹脂純化沙棗總黃酮的性能最好,其最佳分離、純化工藝條件如下:樣品質(zhì)量濃度0.05 mg/mL,上樣pH值為4,上樣流速為0.5 mL/min,最大上樣量為30 mL,洗脫液為60%乙醇,洗脫流速為 0.5 mL/min,最大洗脫體積為40 mL。在所確定的工藝條件下,XAD7HP型大孔樹脂能較好地用于沙棗總黃酮的分離純化,總黃酮的純度由原來的15.24%提高到了48.77%。

    關鍵詞:沙棗;總黃酮;大孔樹脂;分離純化

    中圖分類號: R284.2文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2017)15-0160-04

    沙棗(Elaeagnus Angustifolia L.),別稱桂香柳、七里香等,為胡頹子科胡頹子屬植物,在我國新疆、青海和寧夏等西北省(區(qū))的栽培面積達13萬hm2以上[1],是民間治療嘔吐和胃脹的傳統(tǒng)藥方,多用于脾胃虛弱、消化不良、腸炎腹瀉、肺熱咳嗽等疾病的治療[2]。據(jù)報道,沙棗果實富含黃酮、鞣質(zhì)、齊墩果酸等功能性成分和營養(yǎng)成分,具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腹瀉和抗疲勞等多種藥物用途和營養(yǎng)價值,是西北地區(qū)具有開發(fā)利用前景的重要資源[3-9]。

    近年來,國內(nèi)外科研工作者對沙棗中的主要功能性成分——黃酮開展了一些研究工作。比如Si等從沙棗樹皮中分離得到了兒茶素、表兒茶酸、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、槲皮素和毛地黃黃酮等黃酮類化合物[10]。王基云等研究發(fā)現(xiàn),沙棗花醇提物的總黃酮含量為27 mg/g,能夠抑制自由基誘導的肝臟脂質(zhì)過氧化損傷作用[11]。但是目前仍未有沙棗果黃酮分離純化的研究報道,所以本試驗通過比較7種不同型號的大孔吸附樹脂對沙棗果總黃酮吸附性能的差異,探討分離純化沙棗果總黃酮的工藝條件,以期為沙棗這一特色資源的開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1儀器與設備

    SHA-C型恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司);玻璃柱(Ф 1 cm×30 cm,上海琪特分析有限公司);BT300-2J/YZⅡ25型恒流泵(保定蘭格恒流泵有限公司);SHB-Ⅳ型雙循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);AR2140型電子分析天平(奧豪斯國際貿(mào)易有限公司);LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Heidolph);UV-1800PC-DSLL型紫外-可見分光光度計(上海美普達儀器有限公司);PHS-3C型酸度計(上海楚柏儀器有限公司)。

    1.2材料與試劑

    試驗材料:沙棗,購自新疆哈密瓜鄉(xiāng)果業(yè)股份有限公司。試驗試劑:D101型大孔樹脂(國藥集團化學試劑有限公司);XAD7HP型大孔樹脂(美國羅門哈斯公司);NKA-2、X-5、NKA-9型大孔樹脂(鄭州勤實科技有限公司);HPD100B、AB-8型樹脂(河北滄州寶恩化工有限公司);其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.3試驗方法

    1.3.1大孔樹脂的預處理大孔樹脂用體積分數(shù)95%乙醇浸泡24 h充分溶脹后,濕法裝柱,再用體積分數(shù)95%乙醇淋洗至流出液與水混合液(體積比1 ∶5)不呈白色為止,然后用大量純凈水洗盡乙醇(無醇味),備用。

    1.3.2樣品制備[12]取粉碎后的沙棗,加入20倍(質(zhì)量體積比)的85%乙醇常溫浸泡24 h后過濾、減壓濃縮、60 ℃干燥,制得干燥浸膏樣品。精確稱取干燥浸膏2 g,加90 mL水超聲處理,使其充分溶解后,將溶液定容至100 mL量瓶中,作為備用液。

    1.3.3黃酮含量的測定

    1.3.3.1黃酮標準曲線的制備稱取蕓香苷10.0 mg,用60%乙醇完全溶解,在50 mL容量瓶中定容,得到0.2 mg/mL蕓香苷對照品溶液。

    精確吸取蕓香苷對照品0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL容量瓶中,補加蒸餾水使所有容量瓶內(nèi)液體都在相同刻度線,加1 mL 5% NaNO2,室溫放置6 min;加1 mL 10% Al(NO3)3,室溫放置6 min;加1 mol/L NaOH 10 mL,用60%乙醇定容至25.00 mL,搖勻后放置15 min,在波長 505 nm 處測各溶液的吸光度。以吸光度(ρ)為縱坐標、濃度(C)為橫坐標制作工作曲線,結果得到標準方程為ρ=0.086 9C-0000 6,r2=0.999 9。

    1.3.3.2樣品黃酮含量的測定稱取固體樣品100 mg,加入 HCl-乙醇(體積比1 ∶25,HCl、乙醇濃度分別為1%、70%)定容到10.0 mL,超聲15 min,取2.0 mL上清液,加 1 mL 5% NaNO2,室溫放置6 min;加1 mL 10% Al(NO3)3,室溫放置 6 min,加1 mol/L NaOH 10 mL,用60%乙醇定容至25.00 mL,在波長505 nm處測吸光度。

    1.3.4樹脂的篩選

    1.3.4.1樹脂含水量的測定稱取2 g預處理后抽干水分的大孔樹脂,置于80 ℃的干燥箱中干燥至恒質(zhì)量,根據(jù)樹脂的濕質(zhì)量和干質(zhì)量,用公式Y=(1-m1/m0)×100%計算樹脂的含水量。其中:Y為樹脂的含水量,%;m1為干樹脂的質(zhì)量,g;m0為濕樹脂的質(zhì)量,g。

    1.3.4.2各種樹脂靜態(tài)吸附量和解吸率的測定準確稱取5 g各種型號濕樹脂(用濾紙吸干表面水分),置于100 mL三角錐形瓶中,加入30 mL配制好的沙棗總黃酮水溶液,在 30 ℃ 下以100 r/min的轉(zhuǎn)速在恒溫搖床中振蕩2 h,過濾后取樣品,通過紫外-可見分光光度法測定過濾液濃度,用以下公式可以計算樹脂的靜態(tài)飽和吸附量、吸附率:endprint

    式中:P0為樣品液中總黃酮的初始濃度,mg/mL;Pa為吸附平衡后溶液中總黃酮的濃度,mg/mL;Va為樣品液體積,mL;m為濕樹脂質(zhì)量,g;Y為樹脂的含水量,%。

    取上述經(jīng)靜態(tài)飽和吸附總黃酮后濾出的樹脂,用純凈水沖洗10 min后,用濾紙吸干表面水分,置于錐形瓶中,分別精確加入50 mL體積分數(shù)95%的乙醇,用搖床持續(xù)振蕩5 h后,分別測定洗脫液中總黃酮濃度,按下式計算各型號樹脂的解吸率:解吸率=[洗脫液濃度×洗脫液體積]/[(P0-Pa)×Va]×100%。

    1.3.5大孔樹脂分離純化沙棗總黃酮的工藝優(yōu)化

    1.3.5.1最佳上樣濃度的確定精確稱取5.0 g抽干水分的優(yōu)選樹脂,各7份,分別加入30 mL不同質(zhì)量濃度的沙棗黃酮粗提液,在30 ℃下以100 r/min的轉(zhuǎn)速在恒溫搖床中振蕩2 h,過濾,測定濾液中黃酮含量,計算吸附率。

    1.3.5.2最佳上樣pH值的確定精確稱取5.0 g抽干水分的優(yōu)選樹脂,各5份,分別加入30 mL質(zhì)量濃度為 0.05 mg/mL,pH值為2、4、6、8、10的沙棗黃酮粗提液,在 30 ℃ 下以100 r/min的轉(zhuǎn)速在恒溫搖床中振蕩2 h,過濾,測定濾液中黃酮含量,計算吸附率。

    1.3.5.3最佳上樣流速的確定選用1 cm×30 cm玻璃柱,用優(yōu)選后的樹脂濕法裝柱,按徑高比1 ∶10裝柱。分別取 10 mL 質(zhì)量濃度0.05 mg/mL、pH值為4的沙棗黃酮粗提液,分別以0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min流速上樣,然后用蒸餾水洗脫至流出液接近無色,分別收集流出殘余液、水洗液,繼而用70%乙醇進行洗脫,收集流出液至無色,測定各個收集液中的黃酮含量,并計算吸附率。

    1.3.5.4最佳洗脫液濃度的確定精確稱取5.0 g抽干水分的優(yōu)選樹脂,各5份,分別加入30 mL質(zhì)量濃度為 0.05 mg/mL、pH值為4的沙棗黃酮粗提液,在30 ℃下以 100 r/min 的轉(zhuǎn)速在恒溫搖床中振蕩2 h,過濾,過濾后收集吸附殘液,測定Pa,繼續(xù)用蒸餾水洗脫至流出液接近無色,收集水洗液,然后分別用50 mL 30%、45%、60%、75%、95%乙醇溶液洗脫吸附飽和樹脂,用搖床持續(xù)振蕩5 h后,分別測定洗脫液中總黃酮濃度,計算解吸率,篩選最佳洗脫液濃度。

    1.3.5.5最佳洗脫流速的確定參照“1.3.5.3”節(jié)方法制備沙棗黃酮粗提液,以0.5 mL/min流速上樣,待吸附完全后,先用純凈水洗去未吸附部分至水洗流出液無色后,再用60%乙醇分別以0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL/min的流速洗脫,收集洗脫液,測定洗脫液中總黃酮含量,計算各條件下的解吸率。

    1.3.5.6泄漏曲線制備按“1.3.5.5”節(jié)上樣、沖洗后,再用60%乙醇以0.5 mL/min流速洗脫、分段收集流出液,每 5 mL 收集1次,測定收集液中黃酮含量,繪制泄漏曲線。

    1.3.5.7洗脫曲線制備根據(jù)泄漏曲線試驗結果,取30 mL質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL、pH值為4的沙棗黃酮粗提液,以 0.5 mL/min 流速通過層析柱,吸附飽和后,先用蒸餾水洗去樹脂表面的糖類及雜質(zhì),直至流出液為無色后,再用60%乙醇以0.5 mL/min流速洗脫,每5 mL收集1次,測定洗脫液黃酮含量,繪制洗脫曲線。

    1.3.5.8工藝驗證試驗根據(jù)上述試驗結果,確定沙棗總黃酮最佳純化工藝條件,按此條件平行做3次試驗,分別計算得率和純度,相關公式:

    黃酮得率=洗脫液中總黃酮質(zhì)量/上樣液中總黃酮質(zhì)量×100%;

    黃酮純度=洗脫液中總黃酮質(zhì)量/洗脫液中總固形物質(zhì)量×100%。

    2結果與分析

    2.1樹脂的篩選結果

    由表1可知,XAD7HP、X-5型大孔樹脂的吸附能力較強,其中XAD7HP型樹脂吸附量最大,而且解吸率比X-5高18.06%。經(jīng)比較,確定選用XAD7HP型大孔樹脂。

    2.2大孔樹脂分離純化沙棗總黃酮的工藝優(yōu)化結果

    2.2.1最佳上樣濃度的確定由圖1可以看出,隨著樣品質(zhì)量濃度的增加,樹脂吸附率先上升然后下降并趨于平緩,當樣品質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時,樹脂吸附率達到最大值 84.86%。黃酮溶液濃度是影響樹脂吸附性能的重要因素之一,樣品質(zhì)量濃度增加,則其黏度增大,黃酮向樹脂內(nèi)部傳質(zhì)速度慢,使得有些黃酮沒有及時被吸附就流出來;此外,樣品濃度增加,競爭性吸附的雜質(zhì)也在增加,這些雜質(zhì)的存在減少了有效吸附面積,導致樹脂吸附率下降。從圖1還可看出,提高樣品質(zhì)量濃度有利于提高樹脂的吸附效果,但是樣品質(zhì)量濃度過高的話,反而會降低樹脂吸附率,因此用XAD7HP樹脂吸附沙棗黃酮時,樣品質(zhì)量濃度以0.05 mg/mL左右為宜。

    2.2.2最佳上樣pH值的確定從圖2可以看出,樣品液pH值為4時,XAD7HP樹脂的吸附率最高;當pH值>4時,隨著pH值升高,XAD7HP樹脂的吸附率下降。原因可能是pH值是影響大孔樹脂吸附能力的因素之一,一般來說,酸性化合物在酸性介質(zhì)中的吸附較充分。黃酮類化合物具有酚羥基,顯弱酸性,在酸性條件下吸附較好,但是本試驗中樣品液pH值為2時吸附率不升反降,可能是酸性太強,樣品液中的黃酮類化合物轉(zhuǎn)變?yōu)檠瘥}而溶解,因而不易被吸附[13]。所以,本試驗選擇pH值為4的沙棗黃酮粗提液上樣。

    2.2.3最佳上樣流速的確定表2結果表明,隨著上樣流速的增大,XAD7HP型大孔樹脂的吸附率下降。原因可能是減慢流速能使待分離物質(zhì)和樹脂充分接觸,有利于吸附;但是,流速太慢容易造成死吸附且費時,故根據(jù)試驗結果,選擇上樣流速為0.5 mL/min。

    2.2.4最佳洗脫液濃度的確定由表3可知,隨著乙醇體積分數(shù)的不斷加大,沙棗總黃酮的解吸率先表現(xiàn)為不斷上升;但當體積分數(shù)≥75%時,解吸率反而有所下降??赡茉蚴怯捎谝掖俭w積分數(shù)的升高會增加醇溶性雜質(zhì)含量,使得沙棗總黃酮在洗脫液中的溶解度減小,從而造成了解吸率的先升后降。因此,本試驗選擇60%乙醇作為洗脫劑較為適宜。endprint

    2.2.5最佳洗脫流速的確定從圖3可以看出,隨洗脫流速的加快,沙棗總黃酮的解吸率整體呈下降趨勢。對于一定量的洗脫劑而言,加快洗脫流速,會使洗脫劑中的溶質(zhì)分子與大孔樹脂的作用時間縮短,溶質(zhì)分子來不及擴散到樹脂的內(nèi)表面將黃酮徹底洗脫下來,從而使解吸率下降;但流速過慢時,又會導致操作時間過長,降低生產(chǎn)效率。因此本研究選擇洗脫流速為0.5 mL/min。

    2.2.6泄漏曲線圖4結果表明,沙棗總黃酮在第6份流出液處未吸附率(即洗脫液黃酮濃度)明顯增大,之后變化趨于平緩,說明樹脂柱在第6份流出液處出現(xiàn)泄漏拐點。為最大程度地吸附沙棗總黃酮,同時又節(jié)約料液、提高生產(chǎn)效率,設定第6份處為泄漏點,據(jù)此確定30 mL作為最大上樣量。

    [TPLR44.tif]

    2.2.7洗脫曲線由圖5可以看出,XAD7HP型樹脂的洗脫峰窄而尖銳,被解吸的黃酮主要集中在10~30 mL體積范圍內(nèi)。從第8份流出液開始,總黃酮濃度幾乎沒有變化,說明樹脂柱基本被洗脫干凈。為了節(jié)約洗脫劑,縮短生產(chǎn)周期,確定40 mL作為最大洗脫體積。

    [TPLR55.tif;S+2mm]

    2.2.8工藝驗證結果在最佳工藝條件下,沙棗料液中總黃酮的得率分別為76.42%、78.17%、79.54%,平均得率為 78.04%;總黃酮的純度由原來的15.24%提高到48.77%。

    3結論與討論

    在1 cm×30 cm玻璃柱中,按徑高比1 ∶10濕法裝柱,考察了7種不同型號大孔樹脂對沙棗總黃酮的靜態(tài)吸附及解吸性能,由于XAD7HP型大孔樹脂對沙棗總黃酮有較高吸附量和解吸率,故選用XAD7HP型樹脂進一步優(yōu)化沙棗總黃酮的分離純化參數(shù)。綜合各項試驗結果可以確定:采用30 mL質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL、pH值為4的沙棗黃酮粗提液以 0.5 mL/min 流速上樣,完全吸附后用蒸餾水洗脫至流出液接近無色,繼而用40 mL、60%乙醇以0.5 mL/min速度進行洗脫,可達到XAD7HP型樹脂對沙棗總黃酮分離純化的最佳效果,總黃酮的純度由原來的15.24%提高到了48.77%,試驗結果比較理想。筆者所在課題組將在此試驗結果的基礎上,繼續(xù)深入研究沙棗中的黃酮類化合物成分,采用先進分離純化手段,以期得到高純度的沙棗黃酮單體,并研究其體外抗氧化活性,為更好地開發(fā)利用沙棗這種中藥提供更多科學依據(jù)。

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