土壤芽孢桿菌NDD—1及其拮抗菌短小芽孢桿菌NDY—10的分離、鑒定和抑菌特性

李靜泉　高坤　許繼飛

摘要：從內(nèi)蒙古大唐國際托總托發(fā)電有限責(zé)任公司儲煤區(qū)土壤樣品中篩選到1株拮抗菌株NDY-10及被其抑制的菌株NDD-1。通過菌落形態(tài)和顯微鏡觀察，結(jié)合16S rRNA、gyrB基因比對分析對菌株進行鑒定；采用牛津杯法對菌株NDY-10進行抑菌譜試驗；通過紫外線照射、不同溫度、不同pH值等處理對菌株NDY-10發(fā)酵上清液對菌株NDD-1的抑菌活性及穩(wěn)定性進行研究。結(jié)果表明，經(jīng)鑒定，菌株NDY-10、NDD-1分別為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、土壤芽孢桿菌（Solibacillus sp.）。短小芽孢桿菌NDY-10對土壤芽孢桿菌NDD-1、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用依次減弱，而對枯草芽孢桿菌、酵母菌、青霉菌沒有抑制作用；短小芽孢桿菌NDY-10發(fā)酵上清液抑菌活性受熱處理影響較大，受紫外線照射處理影響較小，在pH值為5～9范圍內(nèi)保持較高的穩(wěn)定性。首次報道了短小芽孢桿菌對土壤芽孢桿菌的抑菌作用。

關(guān)鍵詞：短小芽孢桿菌；土壤芽孢桿菌；分離；鑒定；抑菌；特性

中圖分類號： Q93-331文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）15-0091-05

由于短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）在植物病害防治[1-3]、微生態(tài)制劑[4-5]、水環(huán)境保護[6-8]等方面具有巨大的應(yīng)用潛力，因此近年來逐漸成為研究熱點。已有研究表明，短小芽孢桿菌對多種病原性微生物具有抑菌作用。鄭敏篩選出1株短小芽孢桿菌，在平板試驗中對芒果炭疽病病原菌的抑制率為88.87%，在活體試驗中該株菌的抑菌率高于80%，可有效降低芒果自然腐爛[9]。胡曉璐等以水稻稻瘟病病菌（Magnaporthe grisea）為試驗菌株，發(fā)現(xiàn)短小芽孢桿菌DX01對水稻稻瘟病病原菌孢子萌發(fā)的抑制率為36%[10]。Ghasemi等從伊朗高鹽環(huán)境中篩選出1株短小芽孢桿菌，發(fā)現(xiàn)它可分泌2種幾丁質(zhì)酶（ChiS、ChiL），可抑制多種植物病原菌[11]。于婷等對分離出的短小芽孢桿菌BSH-4菌株及其抗菌蛋白進行抑菌譜研究，發(fā)現(xiàn)它對8種常見蔬菜病原真菌具有抑制作用，其中對黃瓜蔓枯病病菌、番茄早疫病病菌和黃瓜立枯病病菌具有較高的抑菌活性[12]。彭虹旎對篩選出具有抑菌活性的短小芽孢桿菌4D-14進行研究，確定其分泌的抗菌物質(zhì)為小肽類，受蛋白酶影響不大，具有較高的熱穩(wěn)定性[13]。顏愛勤等的研究結(jié)果表明，短小芽孢桿菌JK-SX001菌株產(chǎn)生的非蛋白抗菌物質(zhì)造成病原菌菌絲頂端畸形，形成膨脹，強烈抑制病原真菌菌絲生長，同時通過抑制病原菌孢子產(chǎn)生芽管來抑制分生孢子的萌發(fā)[14]。Aunpad等從短小芽孢桿菌中首次分離到pumilicin 4細(xì)菌素，對耐萬古霉素腸球菌（VRE）和一些革蘭氏陽性細(xì)菌有顯著的抑制作用，經(jīng)鑒定這種細(xì)菌素屬于多肽類物質(zhì)[15]。但有關(guān)短小芽孢桿菌對芽孢桿菌屬及其近緣屬菌株的抑菌作用卻未見報道。本研究分離得到1株拮抗菌株——短小芽孢桿菌NDY-10（B. pumilus NDY-10）及被它抑制的土壤芽孢桿菌NDD-1菌株（Solibacillus sp. strain NDD-1），擴大了短小芽孢桿菌抑菌作用的范圍，并研究了短小芽孢桿菌NDY-10的抑菌譜及該菌株對土壤芽孢桿菌NDD-1菌株的抑菌活性。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1土壤樣品

土壤樣品，采自內(nèi)蒙古大唐國際托克托發(fā)電有限責(zé)任公司的煤炭儲藏區(qū)。

1.1.2主要試劑

牛肉浸膏、葡萄糖、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、酵母提取物、NaCl、MgSO4·7H2O、KH2PO4、瓊脂粉，均為化學(xué)純。

1.1.3培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：0.5%牛肉浸膏，1.0%細(xì)菌學(xué)蛋白胨，1.0% NaCl，用3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2，121℃高壓滅菌30 min。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：每100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入1.5 g瓊脂粉配制而成。

水瓊脂培養(yǎng)基：蒸餾水加瓊脂粉至終濃度為1.5%，121℃高壓滅菌30 min。

馬丁式培養(yǎng)基：1.00%葡萄糖，0.50%蛋白胨，0.10% KH2PO4，0.05% MgSO4·7H2O，1.50%瓊脂粉，121℃高壓滅菌30 min。

1.1.4主要設(shè)備

PowerCycler SL 96 Gradient型PCR儀，購自Analytik Jena AG；GBOX型凝膠成像儀，購自Gene Company Limited；UV-2600A型紫外-可見分光光度計，購自尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1菌株的分離、鑒定

采用稀釋平板涂布法從土壤樣品中分離菌種。向150 mL無菌三角瓶中加入45 mL滅菌水和適量已滅菌小玻璃球，稱取5 g土壤樣品加入三角瓶中，制成土壤懸液，于30 ℃搖床振蕩2 h。用移液器吸取1 mL土壤懸液于無菌試管中，加入9 mL無菌水，混勻后從中吸取1 mL加入第2個無菌試管中并加入9 mL無菌水，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 6個稀釋梯度的土壤懸液。分別吸取200 μL 10-4、10-5、10-6 3個稀釋梯度的土壤懸液均勻涂布在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d。在分離菌株資源過程中發(fā)現(xiàn)有拮抗菌及被抑制菌存在，分別挑取、純化，并驗證其抑菌效果，將拮抗菌命名為NDY-10，將被抑制菌命名為NDD-1，進行菌株鑒定。對菌株進行劃線培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并對菌株分別進行革蘭氏染色和芽孢染色，顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

采用天根生化科技（北京）有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA，對菌株的16S rRNA基因和gyrB基因[16-18]分別進行PCR擴增、測序、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。16S rRNA基因PCR擴增所用引物為27F、1492R，引物序列：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。endprint

1.2.2短小芽孢桿菌NDY-10抑菌譜測定

為了檢測NDY-10菌株的抑菌譜，除NDD-1菌株外再選擇2種革蘭氏陽性菌（枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌）、1種革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）及2種真菌（青霉菌、酵母菌）進行NDY-10菌株的抑菌譜試驗。供試菌株及來源信息見表1。

使用牛津杯法檢測NDY-10菌株的發(fā)酵液對6種供試菌株的抑菌作用。先在培養(yǎng)皿中倒入10 mL左右的水瓊脂培養(yǎng)基，待其冷卻后，對供試菌株作下述處理：對于細(xì)菌供試菌株，將裝有50 mL牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基的三角瓶滅菌后，待其降至60 ℃左右時加入1 mL供試細(xì)菌菌株菌液，輕輕轉(zhuǎn)動使菌液均勻分布在培養(yǎng)基中，在水瓊脂平皿中倒入10 mL左右已加入菌液的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基；真菌供試菌株接入馬丁式培養(yǎng)基中作相同處理。待培養(yǎng)基凝固，在平皿中等間距放入3個牛津杯，輕輕加壓使牛津杯固定在培養(yǎng)基上，每個牛津杯中加入100 μL NDY-10菌株發(fā)酵液。細(xì)菌在 37 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，真菌在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.2.3短小芽孢桿菌NDY-10的抑菌活性及其穩(wěn)定性測定

NDY-10菌株在220 r/min、37 ℃搖床中培養(yǎng)2 d，12 000 r/min 離心15 min，收集上清液。無菌條件下，對發(fā)酵上清液作如下處理。80 ℃處理：上清液在80 ℃水浴鍋中水浴1 h；121 ℃處理：上清液在滅菌鍋中121 ℃條件下處理 30 min；將上清液用3 mol/L HCl、NaOH分別調(diào)節(jié)pH值為3、5、9、11，處理1 h，分別記為pH3、pH5、pH9、pH11處理組；紫外處理：將上清液在超凈工作臺中于紫外線照射下處理1 h；對照：不作任何處理。

然后將高溫處理過的發(fā)酵上清液降至室溫，將不同酸堿度處理過的發(fā)酵上清液pH值調(diào)為7.8。

分別取上述處理過的和未處理的發(fā)酵上清液各6 mL于試管中，向每支試管中加入3 mL NDD-1菌株菌液；同時設(shè)置空白對照組，其處理方法為6 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與3 mL NDD-1菌株菌液混合。在37 ℃、220 r/min搖床中發(fā)酵培養(yǎng)6 h，測定培養(yǎng)前、培養(yǎng)后菌液的D600 nm。每個處理3次重復(fù)，D600 nm取平均值。

抑菌率計算公式：

2結(jié)果與分析

2.1菌株鑒定

拮抗菌株NDY-10為革蘭氏陽性菌，菌落外圈呈現(xiàn)半透明狀態(tài)，中間乳白色，形狀不規(guī)則，菌落扁平，邊緣不整齊，表面濕潤、光滑，有黏性；在顯微鏡下觀察菌體呈細(xì)桿狀，比較長，多數(shù)單獨存在，少部分成鏈排列，芽孢為近端生。將菌株NDY-10的16S rRNA、gyrB基因序列進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株NDY-10的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中短小芽孢桿菌（B. pumilus）的16S rRNA基因序列相似性最高，最大相似度達99%。菌株NDY-10的gyrB基因序列與B. pumilus HTC38的gyrB基因序列相似度為99%（覆蓋率87%），與B. pumilus LLTC93的gyrB基因序列相似度為98%（覆蓋率86%），與B. pumilus NJ-V2的gyrB基因序列相似度為91%（覆蓋率97%），與B. pumilus SH-B9的gyrB基因序列相似度為90%（覆蓋率99%）。因此，將菌株 NDY-10鑒定為短小芽孢桿菌（B. pumilus）。B. pumilus NDY-10的16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為KT036668，其gyrB基因序列的GenBank登錄號為KT036670。菌株NDY-10的16S rRNA、gyrB基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分別如圖1、圖2所示，聚類結(jié)果與BLAST比對分析結(jié)果一致。

被抑制菌株NDD-1為革蘭氏陽性菌，菌落呈半透明狀態(tài)，淡黃色，圓形，菌落飽滿凸起，邊緣整齊，表面濕潤、光滑，有黏性，在顯微鏡下觀察菌體呈短桿狀，多數(shù)單獨存在，少部分成鏈排列，芽孢為端生，芽孢呈圓形，而芽孢桿菌屬菌株的芽孢呈橢圓形，這是土壤芽孢桿菌屬（Solibacillus）菌株區(qū)別于芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株的一個重要特征[19]。將菌株NDD-1的16S rRNA基因序列和gyrB基因序列進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)菌株NDD-1的16S rRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的Solibacillus、Bacillus中部分菌株的16S rRNA基因序列的相似度均達到99%。菌株NDD-1的gyrB基因序列與土壤森林芽孢桿菌（S. silvestris） StLB046的gyrB基因序列相似度為 92% （覆蓋率99%）， 與S. silvestris DSM 12223的 gyrB 基因序列相似度為 91%（覆蓋率99%）， 與B.

表現(xiàn)出不同的抑菌活性。

高溫處理后，NDY-10菌株發(fā)酵上清液對NDD-1菌株的抑菌率下降。80 ℃處理后其抑菌率下降至37.2%，相對抑菌活性為4757%；而121 ℃處理后其抑菌率下降至23.7%，相對抑菌活性為30.31%。表明熱處理對NDY-10菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性有明顯的影響。

在pH值分別為3、5、9、11的處理條件下，NDY-10菌株發(fā)酵上清液對NDD-1菌株的抑菌率分別為30.9%、693%、72.5%、413%，相對抑菌活性分別為39.51%、8862%、92.71%、5281%。可見在pH值為5～9的處理范圍內(nèi)，其發(fā)酵上清液的抑菌活性保持較高的穩(wěn)定性，抑菌率高于69%，相對抑菌活性高于88%。

紫外線處理后NDY-10菌株發(fā)酵上清液對NDD-1菌株的抑菌率為66.4%，相對抑菌活性為84.91%，可見紫外照射對NDY-10菌株發(fā)酵上清液的抑菌活性影響較小。endprint

3討論與結(jié)論

本研究從內(nèi)蒙古大唐國際托克托發(fā)電有限責(zé)任公司儲煤區(qū)土壤中分離、篩選到1株拮抗菌株NDY-10及被其抑制的菌株NDD-1，經(jīng)鑒定，兩者分別為短小芽孢桿菌、土壤芽孢桿菌。在已報道的抑菌性短小芽孢桿菌中，如B. pumilus DX01[10]、B. pumilus SG2[11]、B. pumilus BSH-4[12]、B. pumilus 4D-14[13]、B. pumilus JK-SX001[14]、B. pumilus WAPB4 [15]等均未見有關(guān)短小芽孢桿菌對芽孢桿菌屬及其近緣屬菌株的抑菌作用的報道。B. pumilus NDY-10對S. sp. strain NDD-1的抑制作用擴大了短小芽孢桿菌抑菌作用的范圍。同時通過抑菌譜試驗發(fā)現(xiàn)，B. pumilus NDY-10雖然對S. sp. strain NDD-1具有非常強的抑制作用，但對枯草芽孢桿菌卻無抑制作用，說明B. pumilus NDY-10對芽孢桿菌屬及其近緣屬菌株的抑制作用具有選擇性，其選擇抑制的機制有待進一步研究。

對B. pumilus NDY-10發(fā)酵上清液的抑菌活性及穩(wěn)定性進行研究，結(jié)果顯示，其發(fā)酵上清液的pH值為7.8時，抑菌率為78.2%；抑菌活性受熱處理的影響較大，80 ℃處理后其抑菌率下降至37.2%，121 ℃處理后，其發(fā)酵液的抑菌率下降至23.7%；抑菌活性受紫外線處理的影響較小，紫外線處理1 h后，其發(fā)酵上清液的抑菌率為66.4%；在pH值為5～9的范圍內(nèi)其發(fā)酵上清液保持較高的抑菌活性，抑菌率高于69%。

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