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    綠竹ISSR—PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

    2018-02-06 21:33:55徐雯瞿印權(quán)陳劍成
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年15期
    關(guān)鍵詞:綠竹

    徐雯 瞿印權(quán) 陳劍成

    摘要:以綠竹基因組DNA為ISSR-PCR擴(kuò)增模板,采用單因素試驗(yàn)方法,對(duì)dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA設(shè)置7個(gè)不同濃度梯度進(jìn)行研究,并對(duì)退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行篩選,建立綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序,并利用優(yōu)化后的體系對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選。最終確定的最佳反應(yīng)體系為:20 μL的擴(kuò)增體系中,dNTPs濃度為0.2 mol/L,Mg2+濃度為2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量為1.0 U,引物濃度為0.4 μmol/L,DNA用量為50 ng,10×PCR buffer體積為2 μL、剩余體積用滅菌ddH2O補(bǔ)全。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,(根據(jù)引物的退火溫度)復(fù)性30 s,72 ℃延伸90 s,循環(huán)38次;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。以此體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選,在100條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的引物。[JP2]本研究建立了綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系并篩選出高多態(tài)性引物,為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供了基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:綠竹;ISSR;反應(yīng)體系;擴(kuò)增程序;引物篩選

    中圖分類號(hào): S795.501文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2017)15-0034-05

    綠竹[Dendrocalamopsis oldhami (Munro) Keng f.]是禾本科竹亞科(Bambusoideae)綠竹屬(Dendrocalamopsis)的模式種,是綠竹屬中分布最廣、栽培最多的竹種[1]。綠竹分布在中亞熱帶南部、南亞熱帶的北部和中部,主要分布于東南亞等國(guó)家[2]。綠竹原產(chǎn)我國(guó)臺(tái)灣省淡水,我國(guó)主要分布在浙江南部、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西和海南等省區(qū),是我國(guó)南方優(yōu)良速生的筍材兩用叢生竹種之一,具有較高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值[3]。

    分子標(biāo)記技術(shù)經(jīng)過三代的發(fā)展,已經(jīng)出現(xiàn)了十幾種分子標(biāo)記技術(shù),目前使用比較廣泛且成熟的技術(shù)有SSR、RAPD、ISSR、SRAP、RFLP、AFLP、SNP等[4-5]。ISSR技術(shù)是1994年Zietkiewicz等在SSR分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記方法,它在SSR序列的3′或5′末端加上1~4個(gè)核苷酸作為反應(yīng)的引物,從而擴(kuò)大DNA序列[6]。此種分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單快捷易操作、DNA用量較少、穩(wěn)定性較好、試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn),且擴(kuò)增出的條帶多態(tài)性較好,重復(fù)性較高[7-8]。目前ISSR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、指紋圖譜的構(gòu)建等方面的研究,是目前使用最廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一[9-12]。本試驗(yàn)采用了單因素多水平梯度方法建立綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系并篩選出高多態(tài)性引物,旨在為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供基礎(chǔ)。

    1材料與方法

    1.1試驗(yàn)材料

    供試的材料取自于福建省東山國(guó)有赤山林場(chǎng)的綠竹地理種源試驗(yàn)樣地。對(duì)不同的植株隨機(jī)選取3~5張新鮮葉片,將采集到的新鮮葉片用變色硅膠干燥的方法保存,將干燥的材料迅速帶回實(shí)驗(yàn)室,于-80 ℃超低溫冰箱保存。

    1.2DNA的提取與檢測(cè)

    綠竹全基因組DNA的提取采用杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒(Cat#BSC13S1)法,并對(duì)該種方法略作調(diào)整。提取完后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度。并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性與清晰性,看是否有降解或斷裂現(xiàn)象,將滿足試驗(yàn)條件的DNA稀釋到20 ng/μL,并置于-20 ℃冰箱保存。

    1.3引物篩選

    本試驗(yàn)ISSR引物采用加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100條引物序列,引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,選擇1個(gè)DNA模板對(duì)引物進(jìn)行初步篩選。從中選擇條帶清晰、重復(fù)性好、穩(wěn)定性較高、具有多態(tài)性的引物,最后確定初選引物為U815(圖1)。待最優(yōu)反應(yīng)體系建立后,再進(jìn)行復(fù)篩,從100條引物中最終篩選出14條最適宜的引物。

    [FK(W13][TPXW11.tif;S+2mm][FK)]

    1.4初始PCR擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系

    參照文獻(xiàn)[13-15]并作適當(dāng)調(diào)整,確定初始擴(kuò)增反應(yīng)體系為:20 μL的擴(kuò)增體系中,dNTPs濃度為 0.25 mmol/L,Mg2+濃度為2.5 mmol/L,引物濃度為 0.4 μmol/L,Taq DNA聚合酶用量為1 U,DNA用量為50 ng,10×PCR buffer體積為 2 μL,剩余體積用滅菌ddH2O補(bǔ)齊。初始擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,循環(huán)35次;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

    1.5擴(kuò)增程序的優(yōu)化

    本試驗(yàn)采用單因多水平梯度試驗(yàn)法對(duì)影響PCR反應(yīng)的dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA含量、退火溫度及循環(huán)次數(shù)7個(gè)主要因素進(jìn)行篩選。其中dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度和模板DNA含量這5個(gè)因素設(shè)置7個(gè)梯度濃度水平(表1)。待最優(yōu)反應(yīng)體系建立后,再篩選最佳退火溫度與最佳循環(huán)次數(shù)。使用預(yù)試驗(yàn)中擴(kuò)增效果較好的引物U815對(duì)綠竹的基因組DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳45 min,電壓設(shè)為5 V/cm。并用紫外凝膠成像分析儀進(jìn)行觀察和拍照。

    1.6ISSR有效引物的篩選

    以優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選,在100條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的引物。endprint

    2結(jié)果與分析

    2.1dNTPs對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

    對(duì)dNTPs設(shè)置0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mmol/L 7個(gè)不同濃度梯度,分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖2所示。當(dāng)dNTPs濃度為0.05 mmol/L時(shí),PCR產(chǎn)率很低,高分子量區(qū)域條帶很少,整體條帶都比較暗,當(dāng)dNTPs濃度為0.35 mmol/L時(shí),擴(kuò)增出的條帶也較暗,當(dāng)dNTPs濃度為0.20~0.30 mmol/L時(shí),條帶明亮而清晰,擴(kuò)增效果較好。為降低試驗(yàn)成本,最終選擇dNTPs濃度為0.20 mmol/L。

    2.2Mg2+對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響[JP2]

    不同濃度的Mg2+對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響顯著(圖3),過高過低都會(huì)影響擴(kuò)增的結(jié)果。當(dāng)Mg2+濃度低于或等于1.0 mmol/L時(shí),高分子量區(qū)域沒有條帶,擴(kuò)增出的條帶很暗,[JP2]當(dāng)Mg2+濃度高于或等于2.5 mmol/L時(shí),擴(kuò)增出的條帶又會(huì)出現(xiàn)彌散的現(xiàn)象,當(dāng)Mg2+的濃度為2.0 mmol/L時(shí),擴(kuò)增出的條帶比較清晰、穩(wěn)定。所以Mg2+最佳用量確定為2.0 mmol/L。

    2.3Taq DNA聚合酶對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

    對(duì)Taq DNA聚合酶進(jìn)行單因子篩選的結(jié)果如圖4所示,當(dāng)Taq DNA聚合酶用量為0.50 U時(shí),擴(kuò)增出的條帶較弱,當(dāng)Taq DNA聚合酶用量為1.00 U時(shí),擴(kuò)增出的條帶比較清晰。當(dāng)Taq DNA聚合酶用量高于1.00 U時(shí),低分子量區(qū)域出現(xiàn)彌散現(xiàn)象,不易區(qū)分,當(dāng)濃度過高時(shí)還易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。所以確定Taq DNA聚合酶最佳用量為1.00 U。

    2.4引物濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

    由圖5可知,當(dāng)引物濃度在0.2~0.4 mmol/L時(shí),擴(kuò)增條帶較多,而且清晰且穩(wěn)定;當(dāng)引物濃度高于0.4 mmol/L時(shí),高分子量區(qū)域擴(kuò)增出來的條帶較暗,低分子量區(qū)域擴(kuò)增條帶不穩(wěn)定,還出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增;當(dāng)引物濃度低于0.2 mmol/L時(shí),低分子量區(qū)域擴(kuò)增條帶數(shù)較少,且整體條帶比較暗。最后確定引物最佳用量為0.4 mmol/L。

    2.5模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

    對(duì)模板DNA用量在10~100 ng之間設(shè)置了7個(gè)梯度水平進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果如圖6所示,7個(gè)梯度均能擴(kuò)增出明亮的條帶,且擴(kuò)增出的條帶數(shù)和清晰度差不多,說明模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響較小。在7個(gè)梯度中,模板DNA含量為50 ng時(shí)效果最佳,確定其為最佳濃度。

    2.6退火溫度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

    根據(jù)引物U815的Tm值52.9 ℃,在45~60 ℃之間設(shè)置了12個(gè)溫度梯度,結(jié)果(圖7)顯示,退火溫度對(duì)擴(kuò)增影響明顯,當(dāng)退火溫度較低時(shí),擴(kuò)增特異性較差,條帶較弱且比較模糊,當(dāng)退火溫度升高時(shí),電泳條帶逐漸增多,清晰度也逐漸增強(qiáng),當(dāng)退火溫度為47.5 ℃時(shí),擴(kuò)增的條帶數(shù)最為清晰穩(wěn)定,當(dāng)退火溫度大于47.5 ℃時(shí),高分子量區(qū)域和中等分子量區(qū)域條帶的擴(kuò)增效率下降,直至無擴(kuò)增條帶,且在低分子量區(qū)域也逐漸出現(xiàn)彌散現(xiàn)象,整體電泳條帶數(shù)逐漸減少,清晰度也逐漸減弱,因此,確定引物U815的最佳退火溫度為47.5 ℃。

    2.7循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

    PCR的循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增也有一定的影響。本試驗(yàn)對(duì)循環(huán)次數(shù)設(shè)置了30、32、35、38、40次5個(gè)梯度,試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。當(dāng)循環(huán)次數(shù)為38次時(shí),擴(kuò)增條帶最為清晰明亮其穩(wěn)定。所以選擇38次循環(huán)為ISSR-PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)次數(shù)。

    2.8ISSR有效引物的篩選

    根據(jù)綠竹優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系,對(duì)100條引物進(jìn)行擴(kuò)增。部分引物篩選結(jié)果如圖9所示。結(jié)果顯示,利用建立的體系篩選不同的引物時(shí),大部分引物都能擴(kuò)增出清晰、明亮的條帶,只有少部分引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)較少或不能擴(kuò)增出條帶。說明本試驗(yàn)建立的綠竹的最佳反應(yīng)體系具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。最終在100條引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰不拖尾,穩(wěn)定性較好的引物,分別為UBC807、UBC810、UBC811、UBC815、UBC822、UBC841、UBC856、UBC857、UBC858、UBC859、UBC868、UBC881、UBC895、UBC899。

    3討論與結(jié)論

    3.1討論

    dNTPs作為PCR擴(kuò)增的底物,對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響較大,由圖1可知,當(dāng)dNTPs濃度很低時(shí),DNA的合成速率很低,使得PCR產(chǎn)物單鏈化,擴(kuò)增出的條帶較暗且產(chǎn)量較少;當(dāng)dNTPs濃度較高時(shí),dNTPs容易與Mg2+相鰲合,使得游離的Mg2+濃度降低,從而影響Taq DNA聚合酶的活性,同時(shí)還有可[CM(25]能導(dǎo)致堿基的錯(cuò)誤滲入,使得擴(kuò)增出的產(chǎn)物特異性下降[16-17]。所以正確地選擇好dNTPs的濃度非常重要。

    Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR 擴(kuò)增的影響非常顯著,Mg2+濃度變化直接影響Taq DNA聚合酶的活性,并間接影響引物與模板DNA的雙聯(lián)雜交體的解鏈溫度、引物的退火溫度、擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的生成[17-18]。當(dāng)引物濃度很低時(shí),引物與模板DNA特異性結(jié)合不夠,擴(kuò)增效率較低;而當(dāng)引物濃度較高時(shí),會(huì)增加引物與模板DNA非特異性結(jié)合,以及引物二聚體的生成,從而導(dǎo)致擴(kuò)增效率的下降。本試驗(yàn)設(shè)置的7個(gè)梯度差異顯著,說明Mg2+濃度對(duì)SSR-PCR 擴(kuò)增的影響較大。

    Taq DNA聚合酶直接影響ISSR-PCR擴(kuò)增的成敗,Taq DNA聚合酶的用量受到反應(yīng)體系以及酶的活性等因素的影響[18-19];當(dāng)Taq DNA聚合酶的濃度較低時(shí),擴(kuò)增效率較低,條帶較弱,當(dāng)Taq DNA聚合酶的濃度較高時(shí),會(huì)產(chǎn)生非特異性條帶。所以正確地把握好Taq DNA聚合酶的用量很關(guān)鍵[20]。endprint

    引物濃度的高低會(huì)影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量的多少。當(dāng)引物的濃度過低時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)物量很低,當(dāng)引物的濃度過高時(shí),又會(huì)形成引物二聚體和非特異性擴(kuò)增,此二者也是PCR擴(kuò)增的底物,它們會(huì)和靶序列競(jìng)爭(zhēng)dNTPs和Taq DNA聚合酶,從而導(dǎo)致擴(kuò)增效率的下降[19,21]。

    模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增也有一定的影響,當(dāng)模板DNA的濃度過低時(shí),模板DNA和引物的結(jié)合率就很低,導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物較少;當(dāng)模板DNA的濃度過高時(shí),會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增條帶產(chǎn)生彌散現(xiàn)象,也會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。本試驗(yàn)中模板DNA用量從10~100 ng設(shè)置了7個(gè)梯度,結(jié)果發(fā)現(xiàn),7個(gè)梯度的條帶數(shù)和亮度很相似,并無明顯差別。說明適宜的模板DNA濃度范圍很寬,正常情況下對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響不大,這與其他學(xué)者的研究結(jié)果[22-26]一致。

    退火溫度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響也較大,當(dāng)退火溫度較高時(shí),會(huì)使得模板DNA與引物的親和度下降甚至不能結(jié)合,從而使得擴(kuò)增的條帶數(shù)較少且較模糊;當(dāng)退火溫度較低時(shí),會(huì)導(dǎo)致模板DNA與引物的非特異性結(jié)合[27]。在一定的溫度范圍內(nèi),隨著退火溫度的增加,擴(kuò)增出的產(chǎn)物特異性越好,如果擴(kuò)增結(jié)果相似,盡量選擇其中溫度較高的,一般最佳的退火溫度低于引物的真實(shí)Tm值5 ℃左右[28]。本試驗(yàn)中篩選的最佳退火溫度為47.5 ℃,引物815的真實(shí)Tm值為 52.9 ℃,兩者相差5.4 ℃,在理論范圍內(nèi)。

    循環(huán)次數(shù)也會(huì)影響ISSR-PCR擴(kuò)增,當(dāng)循環(huán)次數(shù)較少時(shí),擴(kuò)增的條帶數(shù)較少,且清晰度較低;當(dāng)循環(huán)次數(shù)過多時(shí),又會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。本試驗(yàn)中當(dāng)循環(huán)次數(shù)為38次時(shí),擴(kuò)增產(chǎn)量較多,條帶清晰,且穩(wěn)定性較好。

    3.2結(jié)論

    最終確定的綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系為:20 μL的擴(kuò)增體系中,dNTPs濃度為0.2 mmol/L,Mg2+濃度為 2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶用量為1.0 U,引物濃度為 0.4 μmol/L,模板DNA用量為50 ng,10×PCR buffer體積為2 μL,剩余體積用滅菌ddH2O補(bǔ)全。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,(根據(jù)引物的退火溫度)復(fù)性30 s,72 ℃延伸90 s,循環(huán)38次;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。以此體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選,在100條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的引物。本研究建立了綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系并篩選出高多態(tài)性引物,為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供了基礎(chǔ)。

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