綠竹ISSR—PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

徐雯　瞿印權(quán)　陳劍成

摘要：以綠竹基因組DNA為ISSR-PCR擴(kuò)增模板，采用單因素試驗(yàn)方法，對(duì)dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA設(shè)置7個(gè)不同濃度梯度進(jìn)行研究，并對(duì)退火溫度和循環(huán)次數(shù)進(jìn)行篩選，建立綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，并利用優(yōu)化后的體系對(duì)100條ISSR引物進(jìn)行篩選。最終確定的最佳反應(yīng)體系為：20 μL的擴(kuò)增體系中，dNTPs濃度為0.2 mol/L，Mg2+濃度為2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶用量為1.0 U，引物濃度為0.4 μmol/L，DNA用量為50 ng，10×PCR buffer體積為2 μL、剩余體積用滅菌ddH2O補(bǔ)全。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，（根據(jù)引物的退火溫度）復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)38次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。以此體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的引物。[JP2]本研究建立了綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系并篩選出高多態(tài)性引物，為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：綠竹；ISSR；反應(yīng)體系；擴(kuò)增程序；引物篩選

中圖分類號(hào)： S795.501文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）15-0034-05

綠竹[Dendrocalamopsis oldhami （Munro） Keng f.]是禾本科竹亞科（Bambusoideae）綠竹屬（Dendrocalamopsis）的模式種，是綠竹屬中分布最廣、栽培最多的竹種[1]。綠竹分布在中亞熱帶南部、南亞熱帶的北部和中部，主要分布于東南亞等國(guó)家[2]。綠竹原產(chǎn)我國(guó)臺(tái)灣省淡水，我國(guó)主要分布在浙江南部、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西和海南等省區(qū)，是我國(guó)南方優(yōu)良速生的筍材兩用叢生竹種之一，具有較高的觀賞價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值[3]。

分子標(biāo)記技術(shù)經(jīng)過三代的發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了十幾種分子標(biāo)記技術(shù)，目前使用比較廣泛且成熟的技術(shù)有SSR、RAPD、ISSR、SRAP、RFLP、AFLP、SNP等[4-5]。ISSR技術(shù)是1994年Zietkiewicz等在SSR分子標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的分子標(biāo)記方法，它在SSR序列的3′或5′末端加上1～4個(gè)核苷酸作為反應(yīng)的引物，從而擴(kuò)大DNA序列[6]。此種分子標(biāo)記技術(shù)具有簡(jiǎn)單快捷易操作、DNA用量較少、穩(wěn)定性較好、試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，且擴(kuò)增出的條帶多態(tài)性較好，重復(fù)性較高[7-8]。目前ISSR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源的鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、指紋圖譜的構(gòu)建等方面的研究，是目前使用最廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)之一[9-12]。本試驗(yàn)采用了單因素多水平梯度方法建立綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系并篩選出高多態(tài)性引物，旨在為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試的材料取自于福建省東山國(guó)有赤山林場(chǎng)的綠竹地理種源試驗(yàn)樣地。對(duì)不同的植株隨機(jī)選取3～5張新鮮葉片，將采集到的新鮮葉片用變色硅膠干燥的方法保存，將干燥的材料迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2DNA的提取與檢測(cè)

綠竹全基因組DNA的提取采用杭州博日公司Biospin植物基因組DNA提取試劑盒（Cat#BSC13S1）法，并對(duì)該種方法略作調(diào)整。提取完后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA的濃度和純度。并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性與清晰性，看是否有降解或斷裂現(xiàn)象，將滿足試驗(yàn)條件的DNA稀釋到20 ng/μL，并置于-20 ℃冰箱保存。

1.3引物篩選

本試驗(yàn)ISSR引物采用加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100條引物序列，引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，選擇1個(gè)DNA模板對(duì)引物進(jìn)行初步篩選。從中選擇條帶清晰、重復(fù)性好、穩(wěn)定性較高、具有多態(tài)性的引物，最后確定初選引物為U815（圖1）。待最優(yōu)反應(yīng)體系建立后，再進(jìn)行復(fù)篩，從100條引物中最終篩選出14條最適宜的引物。

[FK（W13][TPXW11.tif；S+2mm][FK）]

1.4初始PCR擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系

參照文獻(xiàn)[13-15]并作適當(dāng)調(diào)整，確定初始擴(kuò)增反應(yīng)體系為：20 μL的擴(kuò)增體系中，dNTPs濃度為 0.25 mmol/L，Mg2+濃度為2.5 mmol/L，引物濃度為 0.4 μmol/L，Taq DNA聚合酶用量為1 U，DNA用量為50 ng，10×PCR buffer體積為 2 μL，剩余體積用滅菌ddH2O補(bǔ)齊。初始擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5擴(kuò)增程序的優(yōu)化

本試驗(yàn)采用單因多水平梯度試驗(yàn)法對(duì)影響PCR反應(yīng)的dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度、模板DNA含量、退火溫度及循環(huán)次數(shù)7個(gè)主要因素進(jìn)行篩選。其中dNTPs濃度、Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、引物濃度和模板DNA含量這5個(gè)因素設(shè)置7個(gè)梯度濃度水平（表1）。待最優(yōu)反應(yīng)體系建立后，再篩選最佳退火溫度與最佳循環(huán)次數(shù)。使用預(yù)試驗(yàn)中擴(kuò)增效果較好的引物U815對(duì)綠竹的基因組DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳45 min，電壓設(shè)為5 V/cm。并用紫外凝膠成像分析儀進(jìn)行觀察和拍照。

1.6ISSR有效引物的篩選

以優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的引物。endprint

2結(jié)果與分析

2.1dNTPs對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

對(duì)dNTPs設(shè)置0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 mmol/L 7個(gè)不同濃度梯度，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。當(dāng)dNTPs濃度為0.05 mmol/L時(shí)，PCR產(chǎn)率很低，高分子量區(qū)域條帶很少，整體條帶都比較暗，當(dāng)dNTPs濃度為0.35 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶也較暗，當(dāng)dNTPs濃度為0.20～0.30 mmol/L時(shí)，條帶明亮而清晰，擴(kuò)增效果較好。為降低試驗(yàn)成本，最終選擇dNTPs濃度為0.20 mmol/L。

2.2Mg2+對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響[JP2]

不同濃度的Mg2+對(duì)綠竹ISSR-PCR擴(kuò)增的影響顯著（圖3），過高過低都會(huì)影響擴(kuò)增的結(jié)果。當(dāng)Mg2+濃度低于或等于1.0 mmol/L時(shí)，高分子量區(qū)域沒有條帶，擴(kuò)增出的條帶很暗，[JP2]當(dāng)Mg2+濃度高于或等于2.5 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶又會(huì)出現(xiàn)彌散的現(xiàn)象，當(dāng)Mg2+的濃度為2.0 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增出的條帶比較清晰、穩(wěn)定。所以Mg2+最佳用量確定為2.0 mmol/L。

2.3Taq DNA聚合酶對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

對(duì)Taq DNA聚合酶進(jìn)行單因子篩選的結(jié)果如圖4所示，當(dāng)Taq DNA聚合酶用量為0.50 U時(shí)，擴(kuò)增出的條帶較弱，當(dāng)Taq DNA聚合酶用量為1.00 U時(shí)，擴(kuò)增出的條帶比較清晰。當(dāng)Taq DNA聚合酶用量高于1.00 U時(shí)，低分子量區(qū)域出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，不易區(qū)分，當(dāng)濃度過高時(shí)還易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。所以確定Taq DNA聚合酶最佳用量為1.00 U。

2.4引物濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

由圖5可知，當(dāng)引物濃度在0.2～0.4 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增條帶較多，而且清晰且穩(wěn)定；當(dāng)引物濃度高于0.4 mmol/L時(shí)，高分子量區(qū)域擴(kuò)增出來的條帶較暗，低分子量區(qū)域擴(kuò)增條帶不穩(wěn)定，還出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增；當(dāng)引物濃度低于0.2 mmol/L時(shí)，低分子量區(qū)域擴(kuò)增條帶數(shù)較少，且整體條帶比較暗。最后確定引物最佳用量為0.4 mmol/L。

2.5模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

對(duì)模板DNA用量在10～100 ng之間設(shè)置了7個(gè)梯度水平進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖6所示，7個(gè)梯度均能擴(kuò)增出明亮的條帶，且擴(kuò)增出的條帶數(shù)和清晰度差不多，說明模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響較小。在7個(gè)梯度中，模板DNA含量為50 ng時(shí)效果最佳，確定其為最佳濃度。

2.6退火溫度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

根據(jù)引物U815的Tm值52.9 ℃，在45～60 ℃之間設(shè)置了12個(gè)溫度梯度，結(jié)果（圖7）顯示，退火溫度對(duì)擴(kuò)增影響明顯，當(dāng)退火溫度較低時(shí)，擴(kuò)增特異性較差，條帶較弱且比較模糊，當(dāng)退火溫度升高時(shí)，電泳條帶逐漸增多，清晰度也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)退火溫度為47.5 ℃時(shí)，擴(kuò)增的條帶數(shù)最為清晰穩(wěn)定，當(dāng)退火溫度大于47.5 ℃時(shí)，高分子量區(qū)域和中等分子量區(qū)域條帶的擴(kuò)增效率下降，直至無擴(kuò)增條帶，且在低分子量區(qū)域也逐漸出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，整體電泳條帶數(shù)逐漸減少，清晰度也逐漸減弱，因此，確定引物U815的最佳退火溫度為47.5 ℃。

2.7循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響

PCR的循環(huán)次數(shù)對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增也有一定的影響。本試驗(yàn)對(duì)循環(huán)次數(shù)設(shè)置了30、32、35、38、40次5個(gè)梯度，試驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。當(dāng)循環(huán)次數(shù)為38次時(shí)，擴(kuò)增條帶最為清晰明亮其穩(wěn)定。所以選擇38次循環(huán)為ISSR-PCR反應(yīng)的最佳循環(huán)次數(shù)。

2.8ISSR有效引物的篩選

根據(jù)綠竹優(yōu)化后的最佳反應(yīng)體系，對(duì)100條引物進(jìn)行擴(kuò)增。部分引物篩選結(jié)果如圖9所示。結(jié)果顯示，利用建立的體系篩選不同的引物時(shí)，大部分引物都能擴(kuò)增出清晰、明亮的條帶，只有少部分引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)較少或不能擴(kuò)增出條帶。說明本試驗(yàn)建立的綠竹的最佳反應(yīng)體系具有較高的重復(fù)性和穩(wěn)定性。最終在100條引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰不拖尾，穩(wěn)定性較好的引物，分別為UBC807、UBC810、UBC811、UBC815、UBC822、UBC841、UBC856、UBC857、UBC858、UBC859、UBC868、UBC881、UBC895、UBC899。

3討論與結(jié)論

3.1討論

dNTPs作為PCR擴(kuò)增的底物，對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響較大，由圖1可知，當(dāng)dNTPs濃度很低時(shí)，DNA的合成速率很低，使得PCR產(chǎn)物單鏈化，擴(kuò)增出的條帶較暗且產(chǎn)量較少；當(dāng)dNTPs濃度較高時(shí)，dNTPs容易與Mg2+相鰲合，使得游離的Mg2+濃度降低，從而影響Taq DNA聚合酶的活性，同時(shí)還有可[CM（25]能導(dǎo)致堿基的錯(cuò)誤滲入，使得擴(kuò)增出的產(chǎn)物特異性下降[16-17]。所以正確地選擇好dNTPs的濃度非常重要。

Mg2+濃度對(duì)ISSR-PCR 擴(kuò)增的影響非常顯著，Mg2+濃度變化直接影響Taq DNA聚合酶的活性，并間接影響引物與模板DNA的雙聯(lián)雜交體的解鏈溫度、引物的退火溫度、擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的生成[17-18]。當(dāng)引物濃度很低時(shí)，引物與模板DNA特異性結(jié)合不夠，擴(kuò)增效率較低；而當(dāng)引物濃度較高時(shí)，會(huì)增加引物與模板DNA非特異性結(jié)合，以及引物二聚體的生成，從而導(dǎo)致擴(kuò)增效率的下降。本試驗(yàn)設(shè)置的7個(gè)梯度差異顯著，說明Mg2+濃度對(duì)SSR-PCR 擴(kuò)增的影響較大。

Taq DNA聚合酶直接影響ISSR-PCR擴(kuò)增的成敗，Taq DNA聚合酶的用量受到反應(yīng)體系以及酶的活性等因素的影響[18-19]；當(dāng)Taq DNA聚合酶的濃度較低時(shí)，擴(kuò)增效率較低，條帶較弱，當(dāng)Taq DNA聚合酶的濃度較高時(shí)，會(huì)產(chǎn)生非特異性條帶。所以正確地把握好Taq DNA聚合酶的用量很關(guān)鍵[20]。endprint

引物濃度的高低會(huì)影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)量的多少。當(dāng)引物的濃度過低時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物量很低，當(dāng)引物的濃度過高時(shí)，又會(huì)形成引物二聚體和非特異性擴(kuò)增，此二者也是PCR擴(kuò)增的底物，它們會(huì)和靶序列競(jìng)爭(zhēng)dNTPs和Taq DNA聚合酶，從而導(dǎo)致擴(kuò)增效率的下降[19，21]。

模板DNA濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增也有一定的影響，當(dāng)模板DNA的濃度過低時(shí)，模板DNA和引物的結(jié)合率就很低，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物較少；當(dāng)模板DNA的濃度過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增條帶產(chǎn)生彌散現(xiàn)象，也會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。本試驗(yàn)中模板DNA用量從10～100 ng設(shè)置了7個(gè)梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，7個(gè)梯度的條帶數(shù)和亮度很相似，并無明顯差別。說明適宜的模板DNA濃度范圍很寬，正常情況下對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響不大，這與其他學(xué)者的研究結(jié)果[22-26]一致。

退火溫度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增的影響也較大，當(dāng)退火溫度較高時(shí)，會(huì)使得模板DNA與引物的親和度下降甚至不能結(jié)合，從而使得擴(kuò)增的條帶數(shù)較少且較模糊；當(dāng)退火溫度較低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致模板DNA與引物的非特異性結(jié)合[27]。在一定的溫度范圍內(nèi)，隨著退火溫度的增加，擴(kuò)增出的產(chǎn)物特異性越好，如果擴(kuò)增結(jié)果相似，盡量選擇其中溫度較高的，一般最佳的退火溫度低于引物的真實(shí)Tm值5 ℃左右[28]。本試驗(yàn)中篩選的最佳退火溫度為47.5 ℃，引物815的真實(shí)Tm值為 52.9 ℃，兩者相差5.4 ℃，在理論范圍內(nèi)。

循環(huán)次數(shù)也會(huì)影響ISSR-PCR擴(kuò)增，當(dāng)循環(huán)次數(shù)較少時(shí)，擴(kuò)增的條帶數(shù)較少，且清晰度較低；當(dāng)循環(huán)次數(shù)過多時(shí)，又會(huì)增加非特異性擴(kuò)增。本試驗(yàn)中當(dāng)循環(huán)次數(shù)為38次時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)量較多，條帶清晰，且穩(wěn)定性較好。

3.2結(jié)論

最終確定的綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系為：20 μL的擴(kuò)增體系中，dNTPs濃度為0.2 mmol/L，Mg2+濃度為 2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶用量為1.0 U，引物濃度為 0.4 μmol/L，模板DNA用量為50 ng，10×PCR buffer體積為2 μL，剩余體積用滅菌ddH2O補(bǔ)全。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，（根據(jù)引物的退火溫度）復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)38次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。以此體系為基礎(chǔ)進(jìn)行引物篩選，在100條ISSR引物中篩選出14條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的引物。本研究建立了綠竹ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系并篩選出高多態(tài)性引物，為綠竹的指紋圖譜、遺傳多樣性分析、分子育種和品種鑒定等研究提供了基礎(chǔ)。

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