H2O2對白及多糖脫色工藝研究

車向前，常明泉，陳 芳，江蓉敬

0 引言

白及是蘭科植物白及屬[Bletilla striata(thhunb.)reicheb.f.]多年生草本植物的地下干燥塊莖，味苦甘澀,性微寒，富含白及多糖,已證實具有藥理作用的成分有聯(lián)苯類、菲類、萜類[1-4]。白及中的活性成分對葡萄球菌及鏈球菌有抑菌作用，可在局部形成保護(hù)膜，能控制及防止胃部感染；白及多糖能顯著縮短凝血時間，加速紅細(xì)胞的沉降率，使紅細(xì)胞凝集，形成人工血栓，從而修復(fù)血管缺損，達(dá)到止血的作用；白及具有收斂止血、消腫生肌的作用，可治療生瘡出血、咳血，收斂肺氣。目前，研究白及提取工藝的報道較多，而其脫色工藝的研究目前未見報道，脫色后的白及多糖產(chǎn)品市場上也未見供應(yīng)。傳統(tǒng)的白及多糖提取方法為水提醇沉法，對其純化常見的有丙酮-乙醇交替洗脫法，該法由于耗時、耗費大量試劑，成本高，且會有一些試劑殘留，對治療或食用帶來安全隱患。由于白及提取過程中有大量植物色素存在，難以獲得較純的白及多糖，且影響后續(xù)成分研究，對于將白及提取物用于化妝品、食品而言，其色素的存在影響制成品的品質(zhì)[5]。筆者探討使用H2O2脫除白及多糖中的植物色素，獲得較純的白及多糖原料，以拓展白及的應(yīng)用領(lǐng)域，提升后續(xù)開發(fā)產(chǎn)品的質(zhì)量。

1 儀器與材料

TU1901型雙光束紫外/可見分光光度計(北京普析通儀器有限責(zé)任公司)；DHG-9023A型鼓風(fēng)干燥烘箱(天津市順諾儀器科技有限公司，300×300×270)；FA 2004分析天平(天津天才精密儀器廠，精度：0.000 1 g)；WGA-UNI-10型超純水器(功率：300 W，北京普析通儀器有限責(zé)任公司)；無水葡糖糖對照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號：17-03134-01，純度：99.941%)；白及(湖北神農(nóng)本草公司，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院葉立紅教授鑒定為蘭科植物白及)；30% H2O2(黑龍江惠美佳制藥有限公司，批號：20151130)；蒽酮(上海葉緣生物有限公司，批號：20150222)；SSW型電熱恒溫水浴槽(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療器械廠,700 W)；純化水(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院新鮮制備)，鹽酸、氫氧化鈉為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 白及多糖提取液的制備 取白及飲片置60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過10目篩，取該粉末50 g加純化水(藥液比1∶15) 750 mL浸泡60 min,煎煮提取60 min,過濾，收集濾液，藥渣加純化水(藥液比1∶10)500 mL，煎煮提取90 min，過濾，集中濾液，藥渣加純化水(藥液比1∶5)250 min，煎煮提取90 min，過濾，集中濾液，加純化水稀釋至2 000 mL，用蒽酮-硫酸法測定多糖含量使成2.00%(mg/mL)，備用。

2.2 脫色率的測定[6]用紫外分光光度計在473 nm波長處測定脫色前后提取液的吸光度值，計算脫色率。脫色率(%)=(A前-A后)/A前×100%。A前為脫色前提取液的吸光度值，A后為脫色后提取液的吸光度值。

2.3 多糖保留率的測定[7-8]精密稱取在105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品適量，加純化水溶解制備成0.051 5 mg/mL的對照品溶液，取脫色后的提取液稀釋至一定濃度，用蒽酮-硫酸法在620 nm處測定吸收度，計算多糖的含量，多糖保留率(%)=M后/M前×100%。M前為脫色前提取液中多糖的含量，M后為脫色后提取液中多糖的含量。

2.4 H2O2脫色影響因素的考察 分別考察H2O2體積分?jǐn)?shù)、脫色溫度、脫色時間，以及pH值對脫色率、多糖保留率的影響，每個因素設(shè)置5個水平。

2.4.1 H2O2體積分?jǐn)?shù) 取白及多糖提取液50 mL于100 mL三角燒瓶中，共15份，每3份1組，1～5組依次按2%、4%、6%、8%、10%體積分?jǐn)?shù)加入H2O2，混合均勻，調(diào)pH值至8，脫色90 min后移至50 ℃水浴中繼續(xù)攪拌脫色30 min,取出，過濾，取續(xù)濾液測定脫色率和多糖保留率，結(jié)果見圖1、表1。

2.4.2 溫度 取白及多糖提取液50 mL于100 mL三角燒瓶中，共15份，每3份1組，各組分別按體積分?jǐn)?shù)6%加入H2O2，混勻，調(diào)pH值至8，1～5組分別在30、40、50、60、70 ℃中脫色120 min，取出，過濾，取續(xù)濾液測定脫色率和多糖保留率，結(jié)果見圖2、表1。

圖1 H2O2體積分?jǐn)?shù)影響因素

水平因素體積分?jǐn)?shù)(A,%)溫度(B,℃)時間(C,h)pH值(D)1430606264090738501208

圖2 溫度影響因素

2.4.3 時間 取白及多糖提取液50 mL于100 mL三角燒瓶中，共15份，每3份1組，每份均按體積分?jǐn)?shù)6%加入H2O2，混勻，調(diào)pH值至8，1～5組樣品分別于50 ℃水浴中脫色30、60、90、120、180 min，取出，過濾，取續(xù)濾液測定脫色率和多糖保留率，結(jié)果見圖3、表1。

圖3 時間影響因素

2.4.4 pH值 取白及多糖提取液50 mL于100 mL三角燒瓶中，共15份，每組3份，每份分別按體積分?jǐn)?shù)6%加入H2O2，混勻，1～5組分別調(diào)pH值為5、6、7、8、9，然后于50 ℃水浴溫度中脫色120 min，取出，過濾，取續(xù)濾液測定脫色率和多糖保留率，結(jié)果見圖4、表1。

圖4 pH值影響因素

2.4.5 工藝優(yōu)選 根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果，應(yīng)用L9(34)進(jìn)行四因素三水平的正交設(shè)計實驗，確定H2O2對白及多糖的最佳脫色工藝，見表2。以脫色率、多糖保留率為考察指標(biāo)，實驗數(shù)據(jù)采用加權(quán)平均法，實驗所得各項指標(biāo)除以該列最大值，乘以100，為該項得分，對于白及多糖的脫色，首先考慮脫色率，其次是多糖保留率，因而設(shè)定脫色率(X)和多糖保留率(Y)的權(quán)重系數(shù)均為0.5，對2項指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和，即H=0.5 X+0.5 Y，得到綜合評分，見表3。從表3看出，綜合色素脫除率和多糖保留率兩個因素，H2O2用于白及多糖脫色影響因素大小依次為A>B>D>C，其中A因素及B因素中各水平間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。確定最佳脫色條件為A2B3D2C2。

2.4.6 驗證試驗 根據(jù)上述試驗結(jié)果，為了驗證工藝的可靠性，取同一批次白及多糖提取液，加入體積分?jǐn)?shù)為6%的H2O2，將pH值調(diào)至7，在50 ℃下脫色90 min,取出，過濾，測定脫色率和多糖保留率，結(jié)果脫色率為66.80%，預(yù)測試驗脫色率為68.53%，對驗證試驗與預(yù)測試驗的脫色率進(jìn)行比較，結(jié)果RSD為1.81%；驗證試驗多糖保留率為68.60%，預(yù)測試驗多糖保留率為67.11%，對驗證試驗與預(yù)測試驗的多糖保留率進(jìn)行比較，結(jié)果RSD為1.55%。

3 討論

白及多糖中如果存在結(jié)合性色素則難以脫除，白及多糖提取液是弱酸性的，將提取液pH值調(diào)至弱堿性，可促使植物色素細(xì)胞破壁，破壞與多糖的結(jié)合形態(tài)，有利于多糖與色素的分離，從而增強(qiáng)脫色效果。H2O2是一種氧化劑，通過氧化色素使白及多糖脫色[9-11]，H2O2的體積分?jǐn)?shù)是影響脫色效果的重要因素，在本實驗中，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)在6%～10%區(qū)間時，脫色率趨于穩(wěn)定，而多糖保留率則隨著體積分?jǐn)?shù)的增加出現(xiàn)降低趨勢，這是因為H2O2在氧化色素的同時也氧化多糖，使糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變、分解，使多糖損失率增多甚至部分失去活性[12]。在最佳脫色效果、最少多糖損失中探索平衡點，合理掌握H2O2用量。實驗結(jié)果顯示，用H2O2脫色速度快，處理樣品量大，所加入的H2O2在適宜的溫度和時間下可去除,其殘留量遠(yuǎn)低于相關(guān)規(guī)定的限量[13]?；钚蕴渴莻鹘y(tǒng)的脫色劑，脫色效果良好，但脫色后活性炭殘留難以完全去除，影響成品外觀。該結(jié)果低于文獻(xiàn)報道的應(yīng)用活性炭對荔枝多糖的脫色率(93.46%)[14]，與其多糖保留率68.61%的結(jié)果基本吻合，與秦亞東等[15]報道的用粉末活性炭對白芍多糖脫色率65.00%、多糖保留率69.86%接近。實際生產(chǎn)中，脫色率和多糖保留率指標(biāo)需根據(jù)應(yīng)用目的選擇，對于本實驗結(jié)果而言，脫色率達(dá)到60%以上即符合生產(chǎn)需要，在此前提下需盡量多地保留多糖。對于來源于植物的多糖，常含有酚類、羥基蒽醌衍生物等，這類色素大多呈負(fù)性離子，用活性炭脫色的效果不好，而與糖形成結(jié)合型色素用H2O2脫色效果可能優(yōu)于活性炭。

表2 L9(34)H2O2脫色正交實驗結(jié)果

表3 脫色效果方差分析表

在水浴適當(dāng)溫度(50 ℃)下有利于多糖的溶解，降低黏性，增加與色素的分離，在適宜溫度中脫色有助于殘留H2O2的揮盡，避免影響多糖的含量測定。本實驗結(jié)果表明，時間對脫色率與多糖保留率在30～60 min之間有明顯變化，60 min是脫色的臨界時間，在90～180 min之間兩者都趨于穩(wěn)定。本實驗中，體積分?jǐn)?shù)、pH值是影響脫色效果的主要因素，溫度和時間因素次之。用H2O2對白及多糖脫色的最佳工藝為：體積分?jǐn)?shù)6%，pH 7，溫度50 ℃，脫色時間90 min。應(yīng)用該工藝能使白及多糖獲得最佳的脫色效果。

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