利用多重PCR技術構建與PRDC相關的4種病毒病的快速檢測方法

李世震，盛金良

（新疆石河子市一四二團獸醫(yī)站，新疆 石河子 832029）

現代養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，由于集約化程度及環(huán)境等多重條件的影響，給養(yǎng)殖戶帶來的不只是經濟利益的提高，同時也大大提高了疾病的發(fā)生幾率，尤其是大大提高了多種病混合感染的發(fā)病幾率。豬呼吸道疾病綜合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）就是一種由病毒、細菌、環(huán)境應激和豬體免疫力低下相互作用造成的一種多種因素多種病原混合感染的呼吸道疾病綜合征。通常由病毒或者霉形體首先侵襲住的呼吸道，破壞呼吸道的防御屏障，然后各種氣源性病菌就很容易進入呼吸道和肺部，造成繼發(fā)性混合感染。

造成豬呼吸道疾病綜合征的原發(fā)性病原主要為豬瘟病毒（classicalswinefever virus，CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproduetive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）、豬偽狂犬病病毒（porcine pseudorabies virus，PRV）等。這4種病毒病常常呈現混合感染，且可以不同程度的損傷免疫系統(tǒng)，降低機體免疫了，從而加劇混合感染與發(fā)病程度。

依照獸醫(yī)實驗室“科學，公正，準確，高效”的診斷質量方針，為了能夠快速、準確的從根源上進行疫病防控，迫切的需要一種能夠一次性檢測多種病原的檢測方法。多重PCR技術就是在傳統(tǒng)PCR技術的基礎上，在一個反應體系中使用2對及以上的引物，對不同病原進行擴增，這種方法與傳統(tǒng)PCR技術相比，不僅大大減少了多種病原檢測的試驗步驟，而且還保留了PCR技術的特異性與敏感性。

1 材料與方法

1.1 病料及相關試劑

試驗所使用的95份病料來自于新疆石河子市部分地區(qū)的10個規(guī)?；i場。TRIzol試劑購自于Invitrogen公司，Multiplex PCR MasterMix購自上海研謹生物科技有限公司、DNA Maeker I購自北京天根生物工程技術服務有限公司、快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；CSFV、PRRSV、PCV2、PRV擴增所使用的模板均由石河子大學動物科技學院基礎獸醫(yī)學實驗室提供；瓊脂粉購自北京奧博星生物技術有限責任公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇等均為國產分析純。

1.2 引物設計與合成

本實驗為建立引起PRDC的4種病原的快速檢測方法，因此根據PCR反應原理，每一種病原需要上下游引物各一條，共需要設計4對特異性引物。根據相關參考文獻設計特異性引物及序列如表1。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 目的片段擴增所使用的引物

1.3 樣品DNA和總RNA的提取

95份病料樣品RNA提取步驟參照TRIzol說明書進行即可，組織DNA提取按照DNA提取試劑盒說明書進行，提取出來的DNA保存在-20℃，RNA保存問無為-80℃。

1.4 PCR反應條件的選擇

根據4種病原的單重PCR條件， CSFV，PRRSV、PCV2、PRV的多重PCR選用50ul反應體系：Multiplex PCR MasterMix 25ul，CSFV、PRRSV、PCV2、PRV上下游引物（20umol/L）各1ul，4種模板各2ul，ddH2O補至50ul。

反應條件：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火50s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

使用3.0%瓊脂糖進行凝膠電泳，在多重PCR的反應體系里可以擴增出來622bp、490bp、424bp、298bp4條可以清晰分辨的條帶，與單重PCR相比，條帶大小一致。

2 結果分析

使用建立的多重PCR方法對95份病料樣品進行單重PCR與多重PCR擴增對比，通過對比，兩種方法的符合率達到100%。

3 討論

隨著生豬規(guī)?；?、現代化、集約化養(yǎng)殖方式的轉變，多種病原混合感染的現象越來越普遍，豬群疾病的發(fā)生與流行對養(yǎng)豬業(yè)的危害也越來越大，直接制約著生豬養(yǎng)殖的發(fā)展，影響經濟發(fā)展。PRDC的這4種病原又是新疆地區(qū)規(guī)模化豬場普遍存在的，往往發(fā)生混合感染、繼發(fā)感染等，而且單憑臨床癥狀很難對這幾種病做出準確的診斷，傳統(tǒng)的診斷方法，存在操作復雜，過程繁瑣，費時費力等多種因素，因此，構建一種快速的診斷方法對疫病的診斷和流行病學調查都有極大的好處。利用多重PCR技術構建的快速檢測方法，不僅保持了普通PCR技術的靈敏性和特異性，還能夠同時檢測4種病原，是一種快速、簡單、有效的實驗室診斷檢測技術。

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