食管鱗癌組織中GSK3β表達(dá)的臨床意義

劉怡文，孫 蔚，齊義軍，高社干

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)院;河南省腫瘤表觀遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河南洛陽(yáng) 471003

食管癌是世界上最常見的八大惡性腫瘤之一，而中國(guó)每年新增的食管癌患者約占全球的一半。在我國(guó)，約90%食管癌為食管鱗癌。食管癌具有顯著的地域性分布差異，高發(fā)區(qū)與低發(fā)區(qū)發(fā)病率和死亡率可相差500倍，預(yù)后極差，5 a生存率僅10%左右[1]。河南省林州、安陽(yáng)、衛(wèi)輝等是中國(guó)及世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的地區(qū)之一[2]。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)是一個(gè)廣泛表達(dá)的絲氨酸/蘇氨酸激酶，包括GSK3α和GSK3β兩種亞型。雖然GSK3α和GSK3β由不同的基因所編碼，但二者具有85%的同源性，催化結(jié)構(gòu)域具有93%的同源性，在哺乳動(dòng)物中執(zhí)行不同的功能[3]。GSK3β是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵激酶之一，參與慢性炎癥的調(diào)控，并與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[4-15]。本研究旨在分析GSK3β在52例食管鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象52例食管鱗癌及相應(yīng)癌旁(距腫瘤邊緣>5 cm)組織標(biāo)本來(lái)自2011年2月至11月于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療且經(jīng)病理學(xué)確診的食管鱗癌患者。其中男33例，女19例；≤60歲25例，>60歲27例；有吸煙史33例，無(wú)吸煙史19例；有飲酒史42例，無(wú)飲酒史10例；高分化、中分化和低分化分別有15、27與10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例，無(wú)轉(zhuǎn)移39例；浸潤(rùn)深度≤深肌層21例，>深肌層31例；TNM分期為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期者分別有10、29與13例。手術(shù)切除組織離體后經(jīng)福爾馬林固定或冷凍保存。患者術(shù)前均未接受放化療及免疫治療。該項(xiàng)目經(jīng)過(guò)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意，并于術(shù)前獲得患者書面知情同意。

1.2GSK3βmRNA的檢測(cè)上述凍存食管鱗癌及癌旁組織標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍后研磨為粉末，加入適量Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)提取RNA，取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(試劑盒購(gòu)自諾唯贊公司)檢測(cè)GSK3β mRNA。GSK3β特異性引物序列為：上游5’-ATGCCACAG CAGCGTCAG-3’，下游5’-GGTCTGTCCACGGTCTCC-3’；內(nèi)參GAPDH引物序列為：上游5’-GCCA CATCGCTCAGACACC-3’，下游5’-GATGGCAA CAATATCCACTTTACC-3’。GSK3β和GAPDH退火溫度均為60 ℃，經(jīng)40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，計(jì)算2-ΔΔCt，以此表示GSK3β mRNA的表達(dá)水平。

1.3GSK3β蛋白的Westernblot法檢測(cè)將凍存組織如上研磨為粉末，加入適量蛋白裂解液(美國(guó)Invitrogen公司)，離心后取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量。120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉PVDF膜(上海密理博公司)1 h，加GSK3β抗兔單克隆抗體(稀釋度11 000，美國(guó)CST公司)或內(nèi)參GAPDH抗兔多克隆抗體(稀釋度為12 000)，4 ℃過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(稀釋度為13 000)室溫孵育2 h(抗體均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，使用ECL(美國(guó)Invitrogen公司)顯影劑處理PVDF膜后于凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)檢測(cè)目的蛋白條帶，應(yīng)用Image Lab軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.4GSK3β蛋白的免疫組化法檢測(cè)固定組織經(jīng)石蠟包埋、切片后，于60 ℃溶蠟1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，檸檬酸液修復(fù)抗原，采用免疫組化SP超敏試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)檢測(cè)GSK3β蛋白，一抗為抗兔單克隆抗體(稀釋度1200，美國(guó)CST公司)。蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封片。陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為胞質(zhì)或胞核棕黃色顆粒狀著色。于高倍鏡下挑選5個(gè)視野觀察，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分：≤5%為0分，>5%且≤25%為1分，>25%且≤75%為2分，>75%為3分。兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為免疫評(píng)分，取5個(gè)視野免疫評(píng)分的均值，0分為陰性，1～12分為陽(yáng)性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理運(yùn)用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。食管鱗癌及相應(yīng)癌旁組織中GSK3β蛋白陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)，GSK3β mRNA及蛋白表達(dá)水平的比較采用配對(duì)符號(hào)秩和檢驗(yàn)。采用Cox回歸模型篩選食管鱗癌術(shù)后預(yù)后影響因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1食管鱗癌及癌旁組織中GSK3β的表達(dá)GSK3β mRNA及蛋白表達(dá)水平(圖1、表1)結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中兩者的表達(dá)水平均高于癌旁組織。免疫組化染色結(jié)果(圖2)顯示，GSK3β蛋白主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)，部分胞核也可見陽(yáng)性著色；食管鱗癌組織中GSK3β 蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(63.5%)高于癌旁組織(19.2%)，見表2，且GSK3β著色強(qiáng)度和著色范圍隨著食管鱗癌組織分化程度的降低逐漸增加。

T：癌組織；N：癌旁組織圖1 Western blot法檢測(cè)GSK3β蛋白表達(dá)

組別GSK3βmRNAGSK3β蛋白癌旁組織0．800(0．381，1．879)0．530(0．360，0．765)食管鱗癌2．085(0．845，7．420)1．525(1．103，1．630)Z5．1314．022P<0．001<0．001

表中數(shù)據(jù)為中位數(shù)和上下四分位數(shù)

A、B、C：分別為高分化、中分化、低分化食管鱗癌組織;D：癌旁組織圖2 食管鱗癌及癌旁組織中GSK3β蛋白的表達(dá)(SP,×400)

χ2=13.564，P<0.001

2.2食管鱗癌患者預(yù)后影響因素分析52例食管鱗癌患者中共有50例成功完成術(shù)后隨訪，隨訪時(shí)間1～30個(gè)月，另2例因?yàn)槁?lián)系方式改變或拒絕訪問(wèn)而失訪。以食管鱗癌導(dǎo)致的死亡為終點(diǎn)事件，以食管鱗癌組織中GSK3β蛋白表達(dá)水平(“≥中位數(shù)”=1，“<中位數(shù)”=0)，以性別(“男”=1，“女”=0)、年齡(“>60歲”=1，“≤60歲”=0)、吸煙(“有吸煙史”=1，“無(wú)吸煙史”=0)、飲酒(“有飲酒史”=1，“無(wú)飲酒史”=0)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(“陽(yáng)性”=1，“陰性”=0)、浸潤(rùn)深度(“>深肌層”=1，“≤深肌層”=0)、TNM分期(“Ⅲ期”=1，“Ⅰ+Ⅱ期”=0)為自變量，進(jìn)行Cox回歸分析，結(jié)果(表3)顯示，GSK3β蛋白高表達(dá)為食管鱗癌患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表3 食管鱗癌患者術(shù)后預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

3 討論

GSK3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它不僅可通過(guò)抑制磷酸化糖原合成酶的活性，升高機(jī)體血糖濃度，還可通過(guò)調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子(如AP-1、NF-κB、c-Myc、β-catenin、P53和STATs等)的活性或穩(wěn)定性參與多種生理及病理過(guò)程，包括細(xì)胞增生、分化、遷移、黏附、凋亡及炎癥因子產(chǎn)生等，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3-4]。然而，GSK3β在腫瘤發(fā)生及演進(jìn)過(guò)程中的作用目前報(bào)道不一。有報(bào)道[3,5]其促進(jìn)了結(jié)直腸癌、胰腺癌、骨肉瘤、肝癌、卵巢癌、白血病等腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而在口腔癌、皮膚癌、肺癌、乳腺癌等中則發(fā)揮腫瘤抑制作用。

在生長(zhǎng)因子、佛波酯、TLRs、T細(xì)胞受體、CD28、白介素等因子的刺激下，蛋白激酶Akt、P70S6K、P90RSK、PKC、PKA等能夠通過(guò)磷酸化GSK3β的21位和(或)9位絲氨酸殘基而導(dǎo)致其失活[5-12]。NFκB轉(zhuǎn)錄活性升高能夠促進(jìn)炎癥及腫瘤發(fā)生發(fā)展，而GSK3β可調(diào)控NFκB的轉(zhuǎn)錄活性，從而參與腫瘤的演進(jìn)過(guò)程[5,10]。GSK3β還參與了Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，GSK3β失活可使β-catenin在胞質(zhì)內(nèi)積聚同時(shí)轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[8-9]。GSK3β抑制劑LiCl能夠調(diào)控細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，抑制食管鱗癌細(xì)胞EC109的增殖活性[9]。

在非小細(xì)胞肺癌組織中，GSK3β主要表達(dá)于胞質(zhì)，表達(dá)水平顯著低于正常肺組織，并與患者的性別、年齡、吸煙及組織病理類型相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)[13]。LI等[14]應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GSK3β在前列腺癌組織中主要表達(dá)于胞質(zhì)，而在正常前列腺組織中主要表達(dá)于胞核；前列腺癌組織中GSK3β表達(dá)明顯高于正常前列腺組織，且GSK3β的表達(dá)與前列腺癌患者預(yù)后有關(guān)。Zhou等[15]應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，GSK3β在食管癌組織中的表達(dá)較正常食管上皮明顯升高，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究采用免疫組化法檢測(cè)到GSK3β蛋白主要表達(dá)于食管鱗癌細(xì)胞胞質(zhì)，部分胞核也可見陽(yáng)性著色，且隨著分化程度的降低，GSK3β著色強(qiáng)度和著色范圍逐漸增加；定量檢測(cè)結(jié)果顯示食管鱗癌組織中GSK3β mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于相應(yīng)癌旁組織；多因素Cox回歸分析結(jié)果表明GSK3β蛋白高表達(dá)為食管鱗癌患者術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述， GSK3β高表達(dá)可能促進(jìn)了食管鱗癌的發(fā)生，GSK3β可能成為食管鱗癌靶向治療的分子靶點(diǎn)之一。

[1] YUAN X,HE J,Sun F,et al.Effects and interactions of MiR-577 and TSGA10 in regulating esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,6(12):2651

[2] MA S,BAO JY,KWAN PS,et al.Identification of PTK6, via RNA sequencing analysis, as a suppressor of esophageal squamous cell carcinoma[J].Gastroenterology,2012,143(3):675

[3] FRAME S,COHEN P.GSK3 takes centre stage more than 20 years after its discovery[J].Biochem J,2001,359(Pt 1):1

[4] MUKAI F,ISHIGURO K,SANO Y,et al.Alternative splicing isoform of tau protein kinase Ⅰ/glycogen synthase kinase 3beta[J].J Neurochem,2002,81(5):1073

[5] MISHRA R.Glycogen synthase kinase 3 beta: can it be a target for oral cancer[J].Mol Cancer,2010,9:144

[6] EMBI N,RYLATT DB,COHEN P.Glycogen synthase kinase-3 from rabbit skeletal muscle. Separation from cyclic-AMP-dependent protein kinase and phosphorylase kinase[J].Eur J Biochem,1980,107(2):519

[7] WOODGETT JR,COHEN P.Multisite phosphorylation of glycogen synthase.Molecular basis for the substrate specificity of glycogen synthase kinase-3 and casein kinase-Ⅱ(glycogen synthase kinase-5)[J].Biochim Biophys Acta,1984,788(3):339

[8] DOBLE BW,WOODGETT JR.GSK-3:tricks of the trade for a multi-tasking kinase[J].J Cell Sci,2003,116(Pt 7):1175

[9] KOCKERITZ L,DOBLE B,PATEL S,et al.Glycogen synthase kinase-3:an overview of an over-achieving protein kinase[J].Curr Drug Targets,2006,7(11):1377

[10]WANG H,BROWN J,Martin M.Glycogen synthase kinase 3:a point of convergence for the host inflammatory response[J].Cytokine,2011,53(2):130

[11]FORDE JE,DALE TC.Glycogen synthase kinase 3: a key regulator of cellular fate[J].Cell Mol Life Sci,2007,64(15):1930

[12]ALI A,HOEFLICH KP,Woodgett JR.Glycogen synthase kinase-3:properties,functions,and regulation[J].Chem Rev,2001,101(8):2527

[13]XU X,SUN PL,LI JZ,et al.Aberrant Wnt1/β-catenin expression is an independent poor prognostic marker of non-small cell lung cancer after surgery[J].J Thorac Oncol,2011,6(4):716

[14]LI R,ERDAMAR S,DAI H,et al.Cytoplasmic accumulation of glycogen synthase kinase-3 beta is associated with aggressive clinicopathological features in human prostate cancer[J].Anticancer Res,2009,29(6):2077

[15]ZHOU XB,LU N,ZHANG W,et al.Expression and significance of beta-catenin in esophageal carcinoma[J].Ai Zheng,2002,21(8):877