杜氏肌營養(yǎng)不良癥生物學治療的研究進展

劉 悅，馬沛沛，吳士文

杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種致死性的X連鎖隱性肌肉變性疾病，其發(fā)病是由抗肌萎縮蛋白基因移碼突變所致。如不接受治療，DMD患兒在10歲左右喪失行走能力，大多數(shù)患兒最終臥床不起，并發(fā)關(guān)節(jié)攣縮、褥瘡、肺炎，而在20歲前死亡。在過去幾十年中，憑借著糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）的應(yīng)用[1]，多學科綜合護理水平的提高，心臟和呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥的處理，DMD的病程發(fā)展發(fā)生了顯著改變，男性患病可生存至30～40歲。由于臨床對已出生DMD患者治療措施有限，因此，研究者們已將治療戰(zhàn)略從針對疾病修飾途徑的藥理學治療逐步擴展到糾正潛在基因突變的生物治療，如依靠胚胎植入前遺傳學診斷、產(chǎn)前診斷技術(shù)的發(fā)展預(yù)防患病胎兒出生?，F(xiàn)將DMD生物學治療進展作一綜述。

1 針對致病基因

1.1 靶向致病基因脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA） （1）基因替代療法目前具有很大潛力，具體操作為通過將功能性DMD基因轉(zhuǎn)移到DMD患者的骨骼肌、心肌細胞，從而恢復(fù)其抗肌萎縮蛋白。然而，dystrophy全基因組長度達2.3 Mb，難以被多數(shù)病毒基因載體包裝運載。有研究發(fā)現(xiàn)在mdx小鼠模型局部注射的小型肌萎縮蛋白，盡管缺少約70%的編碼序列，但仍可保護mdx小鼠的四肢肌肉和心臟[2,3]。同樣，在貝克肌營養(yǎng)不良癥（Becker muscular dystrophy，BMD）患者中，研究發(fā)現(xiàn)注射小型或微型抗肌萎縮蛋白可使患者臨床癥狀減輕[4]。基于上述證據(jù)，腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）介導(dǎo)的微型抗肌萎縮蛋白基因治療應(yīng)運而生。研究表明微型抗肌萎縮蛋白基因治療可降低DMD動物模型肌酸激酶（creatine kinase，CK）水平并顯著改善其肌肉萎縮表現(xiàn)[3]。（2）基因定向編輯。成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspersed short palindromic repeats，CRISPR）是一個廣泛存在于細菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族，其上游還有一個多態(tài)性的家族基因，該基因編碼的蛋白均可與CRISPR序列區(qū)域發(fā)生作用。因此，該基因被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因（CRISPR associated，Cas）。CRISPR/Cas系統(tǒng)可識別外源DNA，并將它們切斷以沉默外源基因的表達，正是由于這種精確的靶向功能，CRISPR/Cas系統(tǒng)被開發(fā)成一種高效的基因編輯工具。其中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)是研究最深入、應(yīng)用最成熟的一類。當Cas9的內(nèi)切核酸酶與向?qū)Ш颂呛怂幔╣uide Ribonucleic acid，gRNA）鏈結(jié)合時，可精確切割基因組[5]。體外研究表明，CRISPR / Cas9技術(shù)可用于許多不同的突變，包括占DMD突變譜12%～15%的多外顯子重復(fù)[6]。根據(jù)大多數(shù)重復(fù)區(qū)域頭尾結(jié)構(gòu)，一個gRNA就可去除突變并恢復(fù)全長抗肌萎縮蛋白，AAV載體的限制就不再是問題。且Long等[7]已在mdx小鼠模型中證明了CRISPR / Cas9介導(dǎo)恢復(fù)體內(nèi)DMD開放閱讀框的治療潛力。

1.2 靶向致病基因核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）DMD基因突變中外顯子缺失突變最常見，占55%～65%。缺失突變包括移碼編碼和整碼突變兩種類型，移碼突變破壞了開放閱讀框，從而導(dǎo)致患者不能產(chǎn)生抗肌萎縮蛋白。整碼突變雖然也破壞了開放閱讀框，但可產(chǎn)生縮短的、有一定功能的抗肌萎縮蛋白，導(dǎo)致臨床癥狀較輕的BMD。外顯子跳躍技術(shù)是通過引入跳過一個或多個靶向外顯子的替代剪接位點，將DMD患兒的移碼突變類型修改為整碼突變類型，這樣就有可能使臨床癥狀較重的DMD轉(zhuǎn)換為癥狀較輕的BMD[8]。反義寡核苷酸是一種修飾合成的核酸鏈，其長度通常為20～30個核苷酸，由抗肌萎縮蛋白前體信使RNA（messenger RNA，mRNA）的互補序列組成，通過與mRNA上要去除的外顯子剪切序列雜交，干擾剪切機制，從而導(dǎo)致該外顯子跳躍來恢復(fù)閱讀框。目前，已有多種反義寡核苷酸被開發(fā)合成。

外顯子 45～50，47～50，48～50，49～50，50，52 或 52～63缺失所致的移碼突變均可通過跳躍51號外顯子轉(zhuǎn)變?yōu)檎a突變，這將治療大約13%的DMD患者[8]。2'O-甲基低聚核糖核苷硫代磷酸酯（2'O-methyl-ribo-oligonucleosidephosphorothioate，2'OMePS）和磷酸二酰胺嗎啉低聚物（phosphorodiami-date morpholinooligomers，PMOs）是兩種靶向外顯子51的寡聚體，但其生物化學結(jié)構(gòu)、對內(nèi)切核酸酶的穩(wěn)定性和毒性特征均不同。一系列臨床前研究成功驗證了2'OMePS和PMOs在DMD治療中的潛力[9,10]。其中，Yokota等[10]發(fā)現(xiàn)對肌營養(yǎng)不良犬模型進行肌內(nèi)注射2'OMePS和PMOs可介導(dǎo)有效的外顯子跳躍，增加抗肌萎縮蛋白表達，改善其臨床表型。隨后，研究者們對2'OMePS寡聚物（drisapersen）和PMO（eteplirsen）進行了一系列系統(tǒng)的臨床試驗。在一個為期48周的研究中，18名患者以每周6 mg/kg的劑量皮下施用drisapersen（連續(xù)方案）；另一組17名患者則在6周內(nèi)接受了9次注射，然后中斷4周（間歇性方案）；第三組18名患者接受安慰劑治療。24周后，相比安慰劑組，連續(xù)方案組患者步行距離顯著增加（約35 m）。但由于研究結(jié)果顯示藥物的改善作用不夠突出，且出現(xiàn)了蛋白尿等不良反應(yīng)[11]，目前該試驗已被取消。在一項納入12名DMD男孩的雙盲試驗中，一組接受每周一次30 mg/kg eteplirsen靜脈給藥，另一組接受每周一次50 mg/kg eteplirsen靜脈給藥；第三組給予安慰劑。48周后，eteplirsen組與對照組相比，行走距離均延長，活檢中抗肌萎縮蛋白增加了40%～50%，并且該藥耐受性良好[12]。2016年美國食品藥品監(jiān)督管理局宣布如果該藥能成功完成，且完成藥物上市后公司承諾的其他額外試驗[13]，將加速批準eteplirsen的臨床應(yīng)用。

1.3 靶向致病基因編碼蛋白 約15%DMD具有提前終止密碼子，這導(dǎo)致了DMD的mRNA衰變和/或蛋白質(zhì)翻譯的過早停止，最后產(chǎn)生截短的、無功能的蛋白質(zhì)。ataluren（PTC124，商品名Tranlsarna）能夠降低核糖體對過早終止密碼子的敏感性，造成所謂“終止密碼子通讀”[14]，使含有無義突變的基因產(chǎn)生功能性蛋白。但是，目前ataluren的作用機制尚存在爭議[15]。

2014年，歐洲藥品管理局和歐洲委員會批準Translarna品牌藥物用于治療無義突變的DMD患者。Bushby等[16]在同年進行了一項隨機雙盲多中心試驗，納入173名年齡5～20歲的DMD患者。治療48周后，口服ataluren 40 mg/（kg·d）的研究對象（步行距離僅下降13 m）與安慰劑組相比（下降44 m）下降更為緩慢，且過程中未報告嚴重不良事件。2017年完成的第二個atalurenⅢ期臨床試驗未能達到預(yù)期的穩(wěn)定6 min步行距離，且大部分DMD患者無顯著癥狀改善[17]。但對第一次和第二次試驗結(jié)果的薈萃分析顯示，用藥后在臨床癥狀改善和統(tǒng)計數(shù)據(jù)上均顯示患者受益，特別是對6 min步行距離測試成績300～400 m的患者，治療效果顯著[18]?；谝陨辖Y(jié)果，該類藥物的后續(xù)試驗已在多個國家啟動。

1.4 靶向相關(guān)信號通路/分子 抗肌萎縮蛋白缺失會導(dǎo)致肌細胞膜小的斷裂和撕裂，隨著時間推移導(dǎo)致膜不穩(wěn)定性增加，關(guān)鍵離子梯度改變和第二信使路徑破壞。許多治療方法試圖改善膜穩(wěn)定性或改變肌肉內(nèi)因抗肌萎縮蛋白缺失干擾的第二信使信號傳導(dǎo)途徑，另外，將失調(diào)的細胞內(nèi)途徑正?；彩悄壳暗难芯坎呗灾?。例如，肌漿網(wǎng)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣三磷酸腺苷酶1的基因上調(diào)對mdx小鼠表型慢性鈣調(diào)節(jié)及改變興奮性收縮耦合和鈣穩(wěn)態(tài)的蘭尼堿受體（ryanodine receptor，RyR）中RyR1、RyR2的翻譯產(chǎn)生影響[19]，同樣，已有研究證明藥物Rycals有利于改善FK506結(jié)合蛋白與RyR的結(jié)合[20]。另一個重要的信號級聯(lián)是肌肉生長抑制素和骨橋蛋白參與的典型和非典型轉(zhuǎn)化生長因子-β信號傳導(dǎo)，也已被證明在肌肉再生和組織纖維化形成中發(fā)揮作用[21]。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β信號的治療，如抑制肌生長抑制素，同樣是目前是臨床試驗的熱點。其他關(guān)鍵的下游途徑包括核因子κB和抗炎信號及靶向線粒體的化合物功能和組蛋白脫乙酰酶抑制劑也在進行相應(yīng)的研究中[22,23]。

1.5 其他 抗肌萎縮蛋白曾被認為只存在于肌纖維中。但近年Rudnicki及其團隊發(fā)現(xiàn)，其在肌肉干細胞中也可表達[24]。應(yīng)用CRISPR/Cas9對肌肉干細胞的基因進行編輯也是目前的研究熱點。如何準確靶標肌肉干細胞，目前的方法仍需進一步改進。同時利用iPS細胞技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶或CRISPR糾正DMD基因突變的可能性盡管已在實驗室得到驗證[25]，但因可編程的核酸酶有致有害突變的可能，目前仍無法應(yīng)用于臨床。

2 針對臨床表型

2.1 上調(diào)抗肌萎縮蛋白替代蛋白 Utrophin蛋白是一種和抗肌萎縮蛋白具有相似組織結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)合性質(zhì)的同系物，分子量為395 kDa。Utrophin上調(diào)曾經(jīng)是DMD分子治療中首先被考慮的方法之一。Utrophin在子宮肌膜中無處不在，肌肉成熟時逐漸被抗肌萎縮蛋白取代。在成人肌肉中，Urophin在神經(jīng)肌肉和肌腱結(jié)中可見。在DMD患者和mdx小鼠模型的肌肉修復(fù)中觀察到，由于抗肌萎縮蛋白的缺失，Utrophin表達自然增加，以重建肌肉纖維的連續(xù)性[23]。盡管兩種蛋白質(zhì)之間存在一些不同的功能特征，但已有研究表明，Utrophin可在mdx小鼠肌肉中起到有效的替代作用。而ezutromid被發(fā)現(xiàn)具有上調(diào)Utrophin蛋白表達的作用，且已在健康志愿者身上證明其安全性[26]。ezutromid應(yīng)用于DMD患者的有效性和安全性研究目前正在進行中，這項歷時48周的試驗招募了40名來自美國和英國的5～10歲男患兒，并將其分成兩組，各2次/d接受兩種ezutromid制劑中的一種，以確定哪種制劑將在未來的臨床試驗中使用。試驗?zāi)壳耙堰M行至24周，通過肌肉活組織檢查發(fā)現(xiàn)，與基線相比，兩組肌肉損傷明顯減少，并伴有Utrophin蛋白的增加。

2.2 修復(fù)/重新密封受損細胞膜 Houang等[27]一直致力于開發(fā)一種修復(fù)/重新密封DMD中損傷肌細胞膜的膜聚合物。在mdx小鼠和DMD狗模型中，候選藥物之一的泊洛沙姆P188已顯示出在修復(fù)/改善心肌病方面的潛力。另一種基于上述治療策略的分子是層粘連蛋白-111，它是一種天然存在的細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白，功能是促進ECM和肌膜之間的相互作用。有研究發(fā)現(xiàn)，肌內(nèi)注射或全身注射層粘連蛋白-111可改善mdx小鼠的肌營養(yǎng)不良表型[25]。但與P188一樣，層粘連蛋白-111也面臨著與藥物傳遞和分布相關(guān)的挑戰(zhàn)，這兩種藥物都尚未進入臨床試驗。

總之，DMD的治療在過去十年中發(fā)生了巨大的變化，整體前景令人期待，但由于DMD病因復(fù)雜，將這些從各角度發(fā)現(xiàn)的治療方法轉(zhuǎn)化并運用于臨床仍需克服許多障礙。未來仍需多學科協(xié)同、組合治療共同改善DMD的臨床癥狀和整體生活質(zhì)量。

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