菜薹和芥藍(lán)種間雜交胚挽救技術(shù)研究

呂鳳仙，李崇娟，楊 鼎，胡靖鋒，楊紅麗，蘭 梅，徐學(xué)忠，張麗琴，和江明 ，董相書

（1. 云南大學(xué), 云南 昆明 650504；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所, 云南 昆明 650205；3. 國家蔬菜改良分中心云南分中心, 云南 昆明 650205）

0 引言

【研究意義】菜薹（俗稱菜心，Brassica campestrisL., AA, 2n=20），和 芥 藍(lán)（Brassica albograbraL. H. Bailey, CC, 2n=18）均屬十字花科蕓薹屬中不同種的重要薹用蔬菜。菜薹是由易抽薹白菜類蔬菜材料，經(jīng)過長期選育而來的[1]。芥藍(lán)在我國的栽培歷史悠久，但是遺傳育種的研究較為薄弱[2]，生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的品種普遍存在產(chǎn)量低、品質(zhì)差、病蟲害嚴(yán)重等問題[3]。由于二者種質(zhì)資源相對較少，遺傳背景狹窄，單靠種內(nèi)雜交，很難在現(xiàn)有基礎(chǔ)上取得突破性進(jìn)展。通過種間雜交，可以創(chuàng)制新品種，獲得有用的育種材料。但二者存在雜交不親和，不能得到后代，需采用人工胚挽救等方法才能獲得菜薹和芥藍(lán)種間雜交的后代?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】通過遠(yuǎn)緣雜交，可以創(chuàng)造新的雜種優(yōu)勢和新物種、新材料，但遠(yuǎn)緣雜交過程中存在諸多生殖障礙。邱德勃等[4]在蕓薹屬和蘿卜屬植物的遠(yuǎn)緣雜交中發(fā)現(xiàn)，胚乳在發(fā)育過程中解體，導(dǎo)致遠(yuǎn)緣雜種胚的敗育，是受精后不親和以及無法形成成熟種子的主要原因，Chrungu[5]研究發(fā)現(xiàn)，幼胚的離體培養(yǎng)是克服不親和性的有效途徑。梁紅[6]對菜薹與甘藍(lán)正反交，通過雜種胚離體培養(yǎng)，獲得雜交優(yōu)勢顯著的種間雜種。滿紅[7]以二倍體菜薹、四倍體菜薹、二倍體芥藍(lán)、四倍體芥藍(lán)為材料，經(jīng)人工授粉雜交，通過子房培養(yǎng)和胚珠培養(yǎng)，創(chuàng)建了菜薹和芥藍(lán)的種間異源四倍體和異源三倍體種質(zhì)。喬海云[8]以菜薹和芥藍(lán)為試驗材料，運用蕾期授粉結(jié)合胚挽救技術(shù)獲得菜薹與芥菜的種間雜種，為蕓薹種和甘藍(lán)種種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳研究奠定基礎(chǔ)。魏曉云等[9]采用二倍體菜薹和二倍體芥藍(lán)雜交，篩選出親和性較高的材料?！颈狙芯壳腥朦c】前人的研究中雖已經(jīng)獲得菜薹和芥藍(lán)的種間雜種，但對菜薹和芥藍(lán)種間雜種胚挽救過程中，培養(yǎng)基成分、取材時間等細(xì)節(jié)進(jìn)行篩選的研究有待深入進(jìn)行。本試驗通過對菜薹和芥藍(lán)種間雜種胚挽救各個過程進(jìn)行詳細(xì)研究，以提高種間雜種的獲得率。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過設(shè)置不同的取材時間，不同生長調(diào)節(jié)劑配比，不同培養(yǎng)基成分，利用出胚率、增殖系數(shù)、生根率、生根時間等指標(biāo)對各設(shè)定進(jìn)行評估，篩選出最適合菜薹×芥藍(lán)種間雜種胚挽救的實驗方案，為菜薹和芥藍(lán)育種種質(zhì)的創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料菜薹CX20000和芥藍(lán)JL20000均由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所十字花科課題組提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 種間雜交 試驗材料于2020年6月1日播種，7月8日定植于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院十字花科課題實驗基地塑料大棚內(nèi)，常規(guī)栽培管理，菜薹于種間雜交。于雜交前2 d摘除父母本花序上已開放花朵，并套袋隔離，套袋父母本開花當(dāng)天，對菜薹套袋分枝上未開放且未露柱頭的花蕾進(jìn)行剝蕾去雄，授以芥藍(lán)套袋分枝上當(dāng)日開放的花粉，配制CX20000×JL20000雜交組合，授粉后套袋隔離，嚴(yán)防父本以外的花粉污染。

1.2.2 不同培養(yǎng)方式 人工去雄授粉后，于適宜時間，取部分雜交后胚珠進(jìn)行胚挽救培養(yǎng)，留取一部分在植株上繼續(xù)生長，進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，比較兩種方式的出胚率。

1.2.3 不同胚挽救培養(yǎng)基 大田授粉后，于授粉后第12天，選取有明顯膨大胚珠的子房，用自來水沖洗2～3遍，于超凈工作臺內(nèi)用75%酒精浸泡50 s，將酒精倒出后用10%次氯酸鈉浸泡15 min，接著用無菌水沖洗3次，最后用無菌水浸泡3 min。用解剖刀沿子房腹縫線和背縫線處輕輕切開，用鑷子挑取飽滿且呈綠色的胚珠，分別接種到ERM1、ERM2、ERM3、ERM4、ERM5、ERM6、ERM7、ERM8培養(yǎng)基上（表1），每種培養(yǎng)基均設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)接種25～35個胚珠，接種后胚珠在溫度（25±2） ℃、光照12 h·d-1、光照強度1500 lx的條件下培養(yǎng)[8]。接種1周后進(jìn)行觀察，30 d后統(tǒng)計出胚率，篩選適合的胚挽救培養(yǎng)基。

表1 菜薹×芥藍(lán)種間雜種胚挽救培養(yǎng)基成分Table 1 Components in embryo rescue medium for interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

1.2.4 不同取材時間 大田授粉后，分別于授粉后10、11、12、13、14、15 d，選取有明顯膨大胚珠的子房，消毒、滅菌后，挑取飽滿且呈綠色的胚珠，接種到ERM4培養(yǎng)基上，每個取材時間設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)接種30～130個胚珠，接種后胚珠在溫度（25±2）℃、光照12 h·d-1、光照強度1500 lx的條件下培養(yǎng)1周后進(jìn)行觀察，30 d后統(tǒng)計出胚率，觀察不同取材時間出胚率，篩選最適宜的取材時間。

1.2.5 不同增殖培養(yǎng)基 成活并成功分化的胚珠分別轉(zhuǎn)移至DM1、DM2、DM3、DM4培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖分化（表2），每種培養(yǎng)基設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)接種25-27個不定芽，觀察增殖情況，并統(tǒng)計各培養(yǎng)基的增殖系數(shù)，篩選適宜的增殖培養(yǎng)基。

表2 菜薹×芥藍(lán)種間雜種增殖培養(yǎng)基成分Table 2 Components in propagation medium for interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

1.2.6 不同生根培養(yǎng)基 胚珠在增殖培養(yǎng)基上分化至具有完整植株形態(tài)后，轉(zhuǎn)接至1/2MS培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，長至3對真葉后，轉(zhuǎn)移至生長素種類和質(zhì)量濃度不同的RM培養(yǎng)基（表3），每種培養(yǎng)基設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)接種8～16株幼苗，觀察統(tǒng)計各培養(yǎng)基的生根情況。根長適宜的幼苗定植于含育苗基質(zhì)的苗缽后，在溫度20～25 ℃，濕度80%條件下進(jìn)行煉苗，待幼苗生長情況穩(wěn)定后，移栽至紅土∶過篩腐殖土=1∶1比例混合土內(nèi)，常規(guī)肥水管理。定植后的雜種植株，統(tǒng)計其成活率。結(jié)合生根情況與幼苗成活率，篩選最適宜的生根培養(yǎng)基。

表3 菜薹×芥藍(lán)種間雜種生根培養(yǎng)基成分Table 3 Components in rooting medium for interspecific B.campestris × B. albograbra hybrids

1.3 種間雜種形態(tài)學(xué)鑒定

成活后的雜種植株，在正當(dāng)繁茂時觀察其葉形、葉色、葉表面特征、花器官的顏色大小等方性狀，并分別與菜薹和芥藍(lán)兩親本進(jìn)行比較，鑒定雜種的真實性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS23.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚挽救和常規(guī)培養(yǎng)的比較

菜薹×芥藍(lán)種間雜交后，在母本植株上自然生長進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，獲得種子數(shù)為0，而胚挽救培養(yǎng)成功獲得了種間雜種植株，證明菜薹×芥藍(lán)種間雜交后代不結(jié)籽，需通過人工胚挽救培養(yǎng)，才能成功獲得雜種。

2.2 不同培養(yǎng)基成分對出胚的影響

不同成分培養(yǎng)基出胚率如表4所示，共接種雜種胚珠730粒，出胚總數(shù)75粒，其中未添加生長調(diào)節(jié)劑的ERM1培養(yǎng)基上，未見胚珠萌發(fā)；ERM2和ERM3胚珠萌發(fā)率較低，分別為1.33%和2.56%，且差異不顯著；ERM4培養(yǎng)基上出胚率顯著高于其他培養(yǎng)基，為26.32%；ERM5、ERM6、ERM7、ERM8培養(yǎng)基隨著添加的6-BA濃度逐漸增大，出胚率從18.18%逐漸降低至7.77%；因此ERM4（MS+6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1）出胚率最高，為最佳胚挽救培養(yǎng)基。萌發(fā)后的雜種胚均生長良好，接種20 d后出胚情況、40 d后成苗情況、成活胚珠增殖情況均如圖1所示。

圖1 菜薹×芥藍(lán)種間雜種胚挽救情況Fig. 1 Embryo rescue of interspecific B. campestris × B.albograbra hybrids

表4 菜薹×芥藍(lán)雜種胚珠在不同培養(yǎng)基上出胚率Table 4 Embryogenesis rate of B. campestris × B. albograbra hybrid ovules on different media

2.3 不同取材時間對出胚的影響

如表5所示，不同取材時間的胚珠，在ERM4培養(yǎng)基上出胚率均存在差異，授粉后第10天取材，由于胚珠過小，依賴母體而離體培養(yǎng)很難成活，胚珠萌發(fā)率只有4.44%；授粉后第12天取材出胚率最高，為26.32%，且與其他取材時間相比差異顯著；授粉12天以后取材，由于雜種胚逐漸敗育，出胚率逐漸減小，第15天僅有3.33%。因此授粉后第12天為菜薹×芥藍(lán)雜種胚最適宜的取材時間。

表5 菜薹×芥藍(lán)不同取材時間雜種胚珠出胚率Table 5 Embryogenesis rate of B. campestris × B. albograbra hybrid ovules with differed sampling time

2.4 不同增殖培養(yǎng)基的增殖效果

從表6可見，不同培養(yǎng)基增殖效果不同，增殖系數(shù)越大，增殖分化效果越好。DM1增殖系數(shù)為5.37，顯著高于其他培養(yǎng)基；DM2和DM3增殖系數(shù)無顯著差異，分別為4.02、4.15；DM4的增殖系數(shù)顯著小于其他培養(yǎng)基，為2.90。因此DM1（MS+ 6-BA 0.9 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1）為菜薹×芥藍(lán)種間雜種的最佳增殖培養(yǎng)基。

表6 菜薹×芥藍(lán)種間雜種成活胚珠在不同培養(yǎng)基上增殖分化情況Table 6 Proliferation and differentiation of viable ovules in B.campestris × B. albograbra hybrids on different media

2.5 不同生根培養(yǎng)基對生根效果的影響

從表7可知，以不同基本培養(yǎng)基，添加不同種類和不同濃度生長素，生根效果均存在差異。生根率方面，最高的為RM4-1和RM1-1，分別為44.44%和40.74%，二者相比無顯著差異，但顯著高于其他培養(yǎng)基；其次是RM4-2，為37.21%，與RM1-1差異不顯著。生根時間方面，RM4-2平均生根時間為8.33 d，生根最快，且與其他培養(yǎng)基平均生根時間差異顯著。在不同培養(yǎng)基上成功生根后的幼苗，經(jīng)煉苗、移栽后，均未出現(xiàn)死苗現(xiàn)象，幼苗移栽成活率為100%。

表7 菜薹×芥藍(lán)種間雜種不同培養(yǎng)基生根情況Table 7 Rooting of interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids on different media

從圖2可知，添加不同種類生長素，誘導(dǎo)的根形態(tài)也存在差異，添加NAA培養(yǎng)基，幼苗生長的根，表現(xiàn)為短且粗壯、無須根，添加IBA和IAA誘導(dǎo)的根，表現(xiàn)為細(xì)長。以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基時，各培養(yǎng)基均出現(xiàn)部分苗產(chǎn)生鹽害的現(xiàn)象（圖3），鹽害苗葉片部分黃化且逐漸脫落，將MS培養(yǎng)基更換為1/2MS培養(yǎng)基時，這一現(xiàn)象得到緩解（圖4）。綜上所述，幼苗移栽成活率未受不同生根培養(yǎng)基影響，RM4-1、RM1-1和RM4-2的生根率較高，RM4-1和RM4-2培養(yǎng)基上生長的幼苗質(zhì)量較高，RM4-2生根時間最短，生根最快，適用于組培苗的快速繁殖，因此RM4-2（1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1）為菜薹×芥藍(lán)種間雜種胚挽救幼苗的最佳生根培養(yǎng)基。

圖2 菜薹×芥藍(lán)種間雜種生根過程不同生長素生長果Fig. 2 Effects of auxins on growth during rooting of interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

圖3 菜薹×芥藍(lán)種間雜種生根過程鹽害現(xiàn)象Fig. 3 Damage induced by salt at rooting stage of interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

圖4 菜薹×芥藍(lán)種間雜種生根過程Fig. 4 Rooting of interspecific B. campestris × B. albograbra hybrids

2.6 種間雜種形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

對菜薹×芥藍(lán)種間雜種進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并與菜薹和芥藍(lán)各性狀進(jìn)行比較。以菜薹作為母本的種間雜種植株，植株形態(tài)如圖5所示，主薹表面有棱，葉片形狀為長卵圓，葉片顏色為深綠，與母本菜薹更為接近，主薹的顏色為淺綠，且有少量蠟粉，與父本芥藍(lán)更為接近。雜種植株花器官形態(tài)如圖6所示，花朵顏色與父本相同，為白色，花朵大小介于父母本之間。綜合上述形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，初步判斷所得植株為菜薹和芥藍(lán)種間雜交所得真雜種。

圖5 菜薹×芥藍(lán)種間雜種植株形態(tài)Fig. 5 Morphology of interspecific B. campestris × B.albograbra hybrid plant

圖6 菜薹×芥藍(lán)種間雜種花器官形態(tài)Fig. 6 Morphology of floral organ of interspecific B.campestris × B. albograbra hybrid

3 討論與結(jié)論

影響雜交親和性的因素主要包括雜交組合方式和親本的基因型[10]，而親緣關(guān)系越近的兩種植物雜交，越容易獲得成功[11]。劉愛華[12]、栗茂騰[13]、李宗蕓[14]、宋運淳[15]等學(xué)者的研究結(jié)果都表明蕓薹屬A和C基因組較A和B以及B和C之間親緣關(guān)系較近，本試驗進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交的兩親本作物菜薹和芥藍(lán)，分別為蕓薹屬A組和C組染色體中的重要薹用蔬菜，成功獲得了菜薹×芥藍(lán)的種間雜種。李明山[16]、張國慶[17]等學(xué)者的研究結(jié)果表明，胚挽救技術(shù)能夠克服雜交的不親和性，本試驗中進(jìn)行的種間雜交常規(guī)培養(yǎng)無法獲得種子，采用胚挽救技術(shù)獲得了雜交種，證明胚挽救技術(shù)能克服雜交不親和性的困難。

受父母本基因型的影響，授粉后的不同時間胚珠發(fā)育程度不同，譚亞飛[18]利用白菜型油菜黃籽沙遜和芥藍(lán)進(jìn)行種間雜交，胚挽救實驗結(jié)果表明授粉后第11天為最佳取材時間，出胚率最高。而本試驗中，受母本菜薹影響，最佳取材時間為授粉后第12天。Harberd[19]在甘藍(lán)×白菜的雜交研究中發(fā)現(xiàn)，取材時間和培養(yǎng)基種類都會影響胚挽救技術(shù)的結(jié)果。滿紅[7]對四倍體菜薹和四倍體芥藍(lán)的種間雜種進(jìn)行子房培養(yǎng)，最佳的取材時間為授粉后7 d，得胚率為1.53個胚珠/子房。本試驗中授粉后10～15 d取材，進(jìn)行胚珠培養(yǎng)，每個取材時間的出胚率各不相同，且授粉后第12天出胚率最高，為26.32%，而菜薹×芥藍(lán)的胚珠，在5種不同的培養(yǎng)基上萌發(fā)情況也不同，以ERM4培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.5 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1）萌發(fā)率最好，出胚率為26.32%，顯著高于其他培養(yǎng)基。

植物根系的形成與諸多因素有關(guān)，植物生長調(diào)節(jié)劑起著關(guān)鍵作用[20]，當(dāng)生長調(diào)節(jié)劑濃度高于細(xì)胞分裂素時，有利于不定根的誘導(dǎo)。本試驗中在1/2MS和MS中分別添加不同濃度的NAA、 IBA和IAA，試驗數(shù)據(jù)表明，以RM4-1（1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1）生根率最高，高于添加IBA和IAA的培養(yǎng)基。這一結(jié)果與張以忠[21]的 IAA與IBA誘導(dǎo)蕎麥生根的效應(yīng)好于NAA有差異，但與王健省[22]的NAA對雙瓣茉莉水培扦插生根的效果明顯優(yōu)于IAA一致，據(jù)吳大忠[23]的研究結(jié)果表明，不同的無性系生根所需的生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度存在較大的差異，可能是不同植物誘導(dǎo)生根適宜的生長調(diào)節(jié)劑種類不同。另外，本試驗通過添加不同濃度生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)生根發(fā)現(xiàn)，RM4-2（1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1）誘導(dǎo)生根最快，適宜進(jìn)行快繁，實際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)具體需求，選擇適宜的生根培養(yǎng)基成分。

本研究篩選出了適宜菜薹和芥藍(lán)種間雜種的胚挽救實驗方案，為種間雜種的選育奠定了基礎(chǔ)。但通過此試驗獲得的雜交種為異源二倍體，減數(shù)分裂時染色體無法正常聯(lián)會配對，從而無法形成配子，不具有育性，要得到能正常繁殖的雜交種，還需進(jìn)行人工加倍等試驗，克服種間雜種的不育性，選育出具有雜種優(yōu)勢的種間雜種。