PEG400修飾的ZnS:Cu量子點熒光猝滅法檢測農藥敵草快

王艷君，張 帆

（1. 福建技術師范學院, 福建 福清 350300；2. 現(xiàn)代設施農業(yè)福建省高等學校工程研究中心, 福建 福清 350300）

0 引言

【研究意義】農藥敵草快（1,1′-亞乙基-2,2′-聯(lián)吡啶二溴鹽，Diquat）是非選擇型聯(lián)吡啶類陽離子季銨鹽除草劑，具有高水溶性和低揮發(fā)性的特點，因其價格低廉，在全球的應用范圍較廣[1]，具有一定的傳導性，對部分農作物不利[2,3]，且敵草快是一種中低毒性農藥，對哺乳動物有一定的危害，可造成環(huán)境的破壞及水體污染。為應對農藥對人類及環(huán)境造成的威脅，許多研究者對農藥殘留的檢測方法進行不斷探索[4]。建立快速、靈敏和實時檢測環(huán)境與食品中農藥含量的技術對環(huán)境及食品中農藥殘留的檢測具有積極的意義?！厩叭搜芯窟M展】國內外學者對農藥殘留檢測方法進行大量的研究，王紀平等[5]采用表面增強拉曼散射的方法檢測敵草快，當含量在0.05～1.00 μg·kg-1時，檢出限達到0.05 μg·kg-1；趙靜等[6]通過高效液相色譜法建立了一種簡單且易于應用在實際中檢測敵草快的方法；多種類型的量子點用于農藥殘留的檢測， CdTe、CdSe/ZnS 以及 CdSe/ZnSe/ZnS 量子點聯(lián)用檢測有機磷農藥，檢測限為0.05～10.00 μg·L-1[7]；不同的金屬離子摻雜型量子點與傳統(tǒng)的量子點相比，摻雜型量子點的優(yōu)勢具有高熒光量子產率，熱穩(wěn)定性?？赏ㄟ^聚乙二醇、聚乙烯、牛血清白蛋白等改善量子點的表面性能，Li等[8]采用環(huán)芳烴大分子對量子點進行修飾，可實現(xiàn)對草甘膦的特異性檢測，檢測限大幅提高；為提高量子點的檢測靈敏度，在摻雜量子點、表面修飾的基礎上，不斷開發(fā)出分子印跡復合量子點、核酸適配體量子點等，研發(fā)趨勢從有毒性的量子點向無毒性環(huán)境友好型量子點發(fā)展。目前對農藥殘留的檢測方法中，常用色譜法、酶聯(lián)免疫法和電化學分析法檢測農藥殘留，但存在處理過程復雜、儀器設備要求高[9]、價格昂貴等缺點[10]，使得其在現(xiàn)場環(huán)境條件下缺少實用性。因此，建立簡單、快速、有效的檢測方法已成為研究熱點[11]。量子點（QDs）是熒光發(fā)光材料，其制備簡單、穩(wěn)定性好，可作為一種便捷、高效、廉價的農藥檢測材料。國內外研究表明，量子點可與所測化學物質發(fā)生一定的化學或物理反應，從而使量子點發(fā)生熒光猝滅[12]，以生物熒光探針、生物傳感器的形式被廣泛應用，目前已有量子點應用于草甘膦、氟啶胺、殺草強等農藥殘留、抗生素及殺蟲劑等檢測中[13-14]。量子點是由Ⅲ-Ⅴ族或Ⅱ-Ⅵ族元素組成，直徑在1～10 nm，一般可溶于水，其熒光發(fā)射光譜對稱且狹窄，熒光激發(fā)光譜寬且連續(xù)。因此，比普通有機發(fā)光材料、無機磷粉具有更好的光學性能[15-16]。由Ⅱ-Ⅵ族元素組成的ZnS量子點是一種綠色環(huán)保的量子點，但由于它在激發(fā)時容易氧化，且材料的尺寸相對較小，使得電子躍遷受到影響，影響其光學性能，較難廣泛應用。為了使其發(fā)射壽命延長、細胞毒性降低、熒光穩(wěn)定性增強，將量子點與過渡金屬離子進行反應，形成摻雜型量子點，可通過水相合成法制備，水相合成具有環(huán)境友好、價格低廉、操作方便，對設備要求低，可重復性高等優(yōu)勢[16]，化學共沉淀法是目前最常見的合成水溶性量子點的方法，步驟簡單、成本低廉，較適合大規(guī)模的量子點合成，但前驅體和配體的種類和數(shù)量以及實驗參數(shù)對量子點的尺寸及發(fā)光性能影響較大；微波輔助合成法雖加熱均勻、能量利用效率高，但微波可產生與常規(guī)加熱不同的選擇性及可能存在的微波非熱效應等?！颈狙芯壳腥朦c】水相合成法的最大優(yōu)勢是操作簡單、反應條件溫和，合成的粒子穩(wěn)定性好，粉末可存放較長時間后于水溶液中重新分散，尤其是對于生物學材料而言，可選擇不同類型的表面修飾劑控制粒子的表面形貌，為生物標記物的構建提供便利。而關于水相合成法制備水溶性量子點有待深入研究?！緮M解決關鍵問題】在量子點制備時可添加聚乙二醇、殼聚糖、L-半胱氨酸等進行修飾，解決由表面效應和其他原子發(fā)生結合出現(xiàn)團聚的現(xiàn)象，使量子點的結晶度變好，熒光量子產率提升[17-19]，加之ZnS:Cu量子點的細胞毒性低、熒光性能穩(wěn)定，本研究采用水相合成法制備ZnS:Cu量子點，并加入PEG400對量子點進行修飾，利用量子點的熒光猝滅強度來檢測農藥敵草快，探究PEG400對ZnS:Cu量子點的修飾效果、量子點與農藥敵草快的熒光猝滅效果，以期建立一種快捷且靈敏度高的方法用于農藥檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 3-巰基乙酸、硝酸鋅、氯化銅（分析純，麥克林生化科技有限公司）；硫化鈉（Na2S·9H2O，分析純，國藥集團化學試劑股份有限公司），聚乙二醇PEG400（分析純，阿拉丁化學試劑有限公司），無水乙醇、乙醇（95%，分析純，北京壇墨質檢科技有限公司）。

1.1.2 儀器 Nicolet 380型傅里葉紅外光譜（美國熱電公司），970 CRT型熒光分光光度計（上海精科儀器有限公司），F(xiàn)D-1E型臺式冷凍干燥機（北京德天佑科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 PEG400修飾的ZnS:Cu量子點制備 在60 ℃溫度下，依次加入0.1 mol·L-1的硝酸鋅溶液10 mL、0.005 mol·L-1氯 化 銅 溶 液1 mL、140 μL3-巰 基 丙 酸(MPA)、34 mL超純水和一定量PEG400，于恒溫磁力攪拌器充分攪拌40 min[20]，標記為A溶液；將A溶液的pH調節(jié)至7.0，并加入0.1 mol·L-1的硫化鈉溶液7 mL，于室溫下靜置2 min后將pH調至10.0，標記為B溶液；將B溶液置于恒溫磁力攪拌器上攪拌30 min后，置于50 ℃恒溫水浴鍋中陳化2 h取出，即得PEG400修飾的ZnS:Cu水溶膠；取出部分水溶膠并加入80 mL的無水乙醇使其出現(xiàn)沉淀，在5000 r·min-1的條件下離心5 min并分離去除上層溶液，留下白色沉淀并用無水乙醇重復清洗3次，再用超純水溶解沉淀；將所制得的溶液置于真空冷凍干燥箱冷凍干燥2 d，即得粉末狀PEG400修飾的ZnS:Cu量子點[21-22]。

1.2.2 量子點的表征 紫外光譜分析：采用紫外-可見吸收光譜，條件為室溫下，以空氣為參比，200～650 nm掃描，間隔5 nm掃描1次。熒光光譜分析：將樣品稀釋一定倍數(shù)，采用970CRT型熒光分光光度計檢測分析樣品的熒光發(fā)射光譜，狹縫寬10 nm，激發(fā)波長350 nm。紅外光譜分析：采用 KBr 壓片法，室溫下，取1.5 mg量子點粉末與100～120 mg干燥KBr粉末充分研磨，置于模具中進行壓片，將壓片置于傅里葉紅外光譜儀中，400～4000 cm-1掃描。

1.2.3 敵草快對量子點的熒光猝滅分析 農藥敵草快的濃度為0.588 mol·L-1，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?00 μL PEG400-ZnS:Cu量子點溶液、不同濃度的敵草快溶液8 mL分別加入到10 mL比色管中，定容至刻度混勻，設置熒光光譜的激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射狹縫的寬度為10 nm、激發(fā)狹縫的寬度為10 nm，在300～500 nm范圍內進行掃描[23-24]。

1.2.4 量子點的抑菌性和毒性試驗 抑菌試驗：活化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。配制含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基，試驗組加入200 μL PEG400修飾的ZnS:Cu量子點，對照組LB固體培養(yǎng)基中不加量子點，倒平板并劃線，于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，計數(shù)并取平均值，根據(jù)公式：η/%=[（N1-N2）÷N1]×100 ；其中η為抑菌率；N1為無PEG400修飾的ZnS:Cu量子點培養(yǎng)基中單菌落數(shù)；N2為含有PEG400修飾的ZnS:Cu量子點培養(yǎng)基在的單菌落數(shù)[25]。毒性試驗：將同管已轉化的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞分別吸取5 μL加入至4瓶100 mL含5 μL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，并加入200 μL PEG400修飾的ZnS:Cu量子點，充分搖勻，做4組空白對照，放入37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)16～18 h，每隔2 h測定600 nm下的吸光度值（OD值），設4組平行試驗[26,27]，根據(jù)培養(yǎng)時間和對應OD值繪制大腸桿菌生長曲線。

1.2.5 反應時間對熒光猝滅的影響 在確定最適量子點用量及適合的敵草快濃度的條件下，探究反應時間對量子點熒光猝滅的影響。取8 mL適當濃度的敵草快溶液，加入200 μL PEG400修飾的ZnS:Cu量子點，定容至10 mL，測定在0～2 h的時間范圍內，量子點熒光猝滅情況，間隔為30 min，并比較熒光猝滅曲線的變化[23,24]。

2 結果與分析

2.1 不同含量PEG400-ZnS:Cu量子點熒光光譜圖分析

由熒光激發(fā)光譜圖（圖1）可知，在發(fā)射波長不變的情況下，激發(fā)波長不斷增大，量子點的熒光強度先上升后下降，最大值激發(fā)波長為351 nm。PEG400修飾過的ZnS:Cu量子點的熒光強度顯著高于未經(jīng)修飾的量子點。PEG400是一種非離子型溶劑，在常溫下化學穩(wěn)定好，在靜電作用下PEG400與量子點復合，使ZnS:Cu量子點更易溶于水中，降低了量子點顆粒間發(fā)生的團聚現(xiàn)象，從而使其熒光強度提高。PEG400的含量對ZnS:Cu量子點的熒光強度影響顯著，其中添加100 μL PEG400制備的量子點的熒光強度最大，添加200 μL PEG400制備的量子點的熒光強度最小，即在100～200 μLPEG400含量的范圍內，PEG400含量增加，量子點的熒光強度逐漸降低；添加過量的修飾劑PEG400，使量子點溶液黏度增大，根據(jù)架橋作用，ZnS:Cu量子點重新團聚，促使懸掛鍵和不飽和鍵的數(shù)量在量子點表面增多，從而在量子點表面形成缺陷，使熒光強度逐漸降低[18]。

圖1 ZnS:Cu量子點、不同含量PEG-ZnS:Cu量子點熒光激發(fā)光譜Fig. 1 Fluorescence excitation spectra of ZnS: Cu QDs and QDs containing varied amounts of PEG

2.2 不同含量PEG400-ZnS:Cu量子點紅外光譜圖

ZnS:Cu量子點與100 μL、150 μLPEG400修飾量子點的曲線在1383.85 cm-1、1635.40 cm-1和2345.34 cm-1處出現(xiàn)了3個吸收峰（圖2），200 μL PEG400修飾PEG-ZnS:Cu量子點只在1383.85 cm-1、1635.40 cm-1出現(xiàn)2個峰。1635.40 cm-1為C-C的振動吸收，2345.34 cm-1為飽和-CH的振動吸收，1383.85 cm-1為C=O基的反對稱伸縮振動，分析原因是在量子點制備過程中3-巰基丙酸發(fā)生水解反應含C=O的部分與Zn2+發(fā)生絡合[28]。在3400 cm-1處未出現(xiàn)-OH的吸收峰，分析原因可能是由于制備量子點過程中-OH發(fā)生充分反應造成的。且100 μL PEG400修飾的ZnS:Cu量子點透過率最低、200 μL PEG400修飾的ZnS:Cu量子點透過率最高。透過率越低，其吸收值越高，可以表明100 μL PEG400修飾的ZnS:Cu量子點吸收值最高。

圖2 ZnS:Cu量子點與不同含量PEG400修飾的PEGZnS:Cu量子點的紅外光譜Fig. 2 Infrared spectra of ZnS:Cu QDs and QDs modified with varied amounts of PEG400

2.3 不同含量PEG400-ZnS:Cu量子點紫外光譜圖分析

量子點的紫外吸收范圍較廣，添加PEG修飾的各量子點在240 nm附近有最大的吸收峰（圖3），隨著波長的增加，吸光度值逐漸降低；而ZnS:Cu在235 nm附近出現(xiàn)最大的吸收峰。這主要是由于ZnS:Cu量子點發(fā)生電荷躍遷造成的，由過渡金屬Cu2+受到輻射能激發(fā)后，一個電子從給予外層軌道向接受體躍遷產生。此外，PEG400修飾的ZnS:Cu量子點的吸收范圍比ZnS:Cu量子點寬，可能是由于PEG400中含有環(huán)氧乙烷，其中含有的-OH是助色基團，從而使吸收峰發(fā)生紅移。

圖3 ZnS:Cu量子點與不同含量PEG400修飾的PEGZnS:Cu量子點的紫外光譜Fig. 3 UV spectra of ZnS:Cu quantum dots and QDs modified with varied amounts of PEG400

2.4 敵草快濃度對PEG400修飾的ZnS:Cu量子點的熒光猝滅的影響

由圖4可知，在351 nm附近100 μL PEG400-ZnS:Cu量子點具有最大熒光值846.36，加入不同濃度的敵草快后，100 μL PEG400-ZnS:Cu量子點的熒光強度明顯下降，隨著敵草快濃度從0增至13.05×10-6mol·L-1，100 μL PEG400-ZnS:Cu量子點的熒光值降低至初始的5.56%。試驗表明，PEG400-ZnS:Cu量子點與敵草快之間存在熒光猝滅效應，并在敵草快濃度較低時（1.45×10-6mol·L-1）熒光猝滅響應迅速。

圖4 敵草快濃度對量子點的熒光猝滅光譜圖Fig. 4 Fluorescence quenching spectra of QDs with varied diquat concentrations

由Stern-Volmer方程：I0/I=1+Ksv[S]，其中I0為在351 nm處不加入量子點的熒光值，I表示在351 nm處加入不同濃度敵草快后量子點的熒光值，[S]為敵草快的濃度，Ksv為敵草快對PEG400-ZnS:Cu量子點的猝滅常數(shù)[23,24]。當敵草快濃度處于1.45×10-6～8.70×10-6mol·L-1時I0/I與[S]之間有較好的線性關系（圖5），相關系數(shù)R2=0.9999。經(jīng)計算Ksv=67.5×104L·mol-1·s-1。取2.90×10-6mol·L-1的 敵 草 快 進 行5次空白測定后的相對標準偏差是0.9964%，檢出限為2.071×10-7mol·L-1，表明敵草快對PEG400修飾的ZnS:Cu量子點的熒光猝滅的靈敏度較好。

圖5 熒光強度與敵草快濃度的Stern-Volmer關系方程Fig. 5 Stern-Volmer equation on relationship between fluorescence intensity and diquat concentration

2.5 反應時間對PEG400修飾的ZnS:Cu量子點熒光猝滅的影響

選取濃度為2.90×10-6mol·L-1的敵草快，加入100 μLPEG400-ZnS:Cu量子點，反應150 min并進行熒光強度的檢測。結果由圖6可知，加入敵草快后，100 μL PEG400-ZnS:Cu量子點會迅速發(fā)生猝滅，但是在前60 min內，隨著反應時間增加，熒光值降低，在60 min之后熒光值增高并保持穩(wěn)定，因此，量子點與敵草快的熒光猝滅的檢測時間為60 min后。

圖6 反應時間對量子點的熒光猝滅的光譜圖Fig. 6 Spectrogram of fluorescence quenching of QDs by reaction time

2.6 PEG400修飾的ZnS:Cu量子點的抑菌性檢測

PEG400修飾的ZnS:Cu量子點對大腸桿菌生長的影響由表1可知，未添加量子點情況下大腸桿菌的平均數(shù)為275；添加量子點后大腸桿菌的平均數(shù)為230。計算抑菌率η為16.36%，小于50%，說明PEG400修飾的ZnS:Cu量子點對大腸桿菌無抑菌性。

表1 量子點對大腸桿菌生長的平板計數(shù)測定Table 1 Plate counts of Escherichia coli by QDs

2.7 PEG400修飾的ZnS:Cu量子點的毒性檢測

大腸桿菌的生長曲線，由圖7可知，在培養(yǎng)8 h后菌體進入對數(shù)增長期，12 h后逐漸平緩。加入100 μLPEG400修飾的ZnS:Cu量子點的大腸桿菌生長曲線與未加入量子點保持相同的生長趨勢，且添加量子點的曲線在未添加量子點上方，可能是因為量子點在600 nm處有一定的吸光度，結合平板計數(shù)可知，將PEG400加入到ZnS:Cu中，并未產生致毒物質。所以PEG400修飾的ZnS:Cu量子點有望用于生物檢測中。

圖7 量子點對大腸桿菌的生長的影響Fig. 7 Effect of quantum dots on the growth of Escherichia coli

3 討論與結論

本研究通過水相合成法制備PEG400修飾的ZnS:Cu量子點，復合量子點的熒光強度明顯高于未經(jīng)PEG400修飾的ZnS:Cu量子點，以100 μL PEG400修飾的ZnS:Cu量子點與農藥敵草快具有較好的熒光猝滅響應，在敵草快濃度為1.45×10-6-8.7×10-6mol·L-1時PEG400-ZnS:Cu的熒光猝滅與敵草快的濃度存在一定的線性關系，相關系數(shù)R2達到0.9999，檢出限為2.071×10-7mol·L-1且熒光猝滅迅速，在反應60 min之后基本穩(wěn)定。通過以大腸桿菌典型模式生物[29]進行量子點抑菌性及毒性檢測表明，PEG400修飾的ZnS:Cu量子點對大腸桿菌沒有抑菌性和生物毒性，量子點的使用并沒有通過生態(tài)鏈底層的微生物來打破生態(tài)平衡[30]，保障了環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略。因此，PEG400修飾的ZnS:Cu量子點，是一種具有高熒光強度、且無毒、水溶性好、對環(huán)境污染小的量子點類型[31]。

近年來，量子點材料在環(huán)境、食品等農藥殘留方面被廣泛應用，這得益于兩個方面，其一，高光致發(fā)光性，本試驗制備ZnS:Cu量子點，是一種具有高光致發(fā)光性的水溶性量子點[27]，與單純的ZnS量子點相比，Cu2+的加入可以使量子點的性能更加完善，陸夢晨等[22]的研究結果顯示：Cu2+的加入修復了ZnS量子點表面的缺陷，由此使其發(fā)光性能得到增強。其二，量子點的表面效應，當量子點尺寸達到納米級別時，表現(xiàn)量子化效應，顯示出優(yōu)越的光學特性。比表面積增大，使得量子點表現(xiàn)出較高的表面能及不飽和度，從而引發(fā)量子點團聚及表面缺陷，以PEG400修飾后的量子點在一定程度上彌補了表面缺陷，聚乙二醇的加入使量子點表面包裹了更多具有親水性的羥基，提高量子點的水溶性，而水溶性的量子點具有更穩(wěn)定的熒光特性[32]。

在探究敵草快的熒光猝滅效果的研究中，本研究獲得的熒光猝滅法將PEG400修飾的ZnS:Cu量子點可用于農藥敵草快的快速檢測中，是一種便捷、經(jīng)濟、準確度和靈敏度都較高的方法，可為農藥檢測方法的探索及生物傳感的發(fā)展提供數(shù)據(jù)支持。