索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)的影響

徐 瀚， 周 石， 王黎洲， 安天志， 蔣天鵬， 宋 杰， 李 興

原發(fā)性肝癌是世界上最常見癌癥之一，死亡率位居癌癥死亡第2［1］。據(jù)2000年癌癥發(fā)病率報(bào)告，原發(fā)性肝癌在女性最常見惡性腫瘤中排名第8，在男性中名列第5［2］。因此，亟需盡快尋找一種針對(duì)肝癌的新治療方法及新治療靶點(diǎn)。目前對(duì)肝癌的治療策略包括傳統(tǒng)外科切除術(shù)［3］、細(xì)胞生物治療［4-5］、介入治療［6-7］、局部放療［8］、傳統(tǒng)化療［9］、中藥治療［10］及分子靶向藥物治療等。索拉非尼是目前唯一被我國(guó)及歐美多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)應(yīng)用于中晚期肝癌治療的分子靶向藥物，其通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平，達(dá)到抑制肝癌組織新生血管及微血管生成目的［11］。 B7 蛋白家族包括 B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4，它們是一組與T細(xì)胞和B細(xì)胞活化及免疫功能有關(guān)的共刺激分子，被廣泛應(yīng)用于自身免疫疾病和癌癥治療［12-13］。本研究旨在以免疫印跡法（western blot，WB）觀察不同人肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、 QGY-7703、 SMMC-7721、 MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6）和正常人肝細(xì)胞株（HL-7702）蛋白表達(dá)，在其中篩選出B7-H3和B7-H4蛋白高表達(dá)細(xì)胞株并應(yīng)用索拉非尼，WB和溴化噻唑藍(lán)四氮唑（MTT）比色法檢測(cè)B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)，了解索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株的抑制作用及B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中過表達(dá)是否常見，從而為肝癌預(yù)防和治療提供一候選新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

細(xì)胞培養(yǎng)采用10%胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基 （HyClone，Logan，Utah，USA）和 DMEM 培 養(yǎng) 基（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）；抗 β-肌動(dòng)蛋白、B7-H3蛋白、B7-H4蛋白（一抗）及辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的二抗（Sigma-Aldrich，Taufkirchen， Germany）；索 拉 非 尼 原 粉 藥 劑 （LKT Laboratories，St Paul，Minnesota，USA）；增強(qiáng)型二辛可酸（BCA）蛋白測(cè)定試劑盒（Beyotime，Haimen，China）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株包括 HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、 QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6（美國(guó)菌種保藏中心 ATCC，Manassas，VA，USA）； 正常人肝細(xì)胞株為 HL-7702（ATCC， Manassas，VA，USA）。所有細(xì)胞均在37℃、5%二氧化碳和95%空氣環(huán)境中置于含10%胎牛血清并加入100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.3 索拉非尼抑制人肝癌細(xì)胞株測(cè)定

采用MTT比色法評(píng)價(jià)索拉非尼對(duì)Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 肝 癌 細(xì)胞株的抗增殖活性作用。將不同人肝癌細(xì)胞株接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后分別給細(xì)胞加入0（對(duì)照）、1.25、2.5、5、10、15、20、40 μmol/L 劑量索拉非尼，48 h后混合MTT并再培養(yǎng)3 h，最后用微板讀數(shù)器（Perkin-Elmer，USA）在 570 nm 處檢測(cè)光密度（OD）。以公式抑制率（%）＝（OD對(duì)照－OD處理）/OD對(duì)照×100%［14］計(jì)算索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株抑制率。

1.4 WB檢測(cè)

對(duì) HepG2、Hep3B、BEL-7402、BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6、HL-7702 細(xì)胞株，分別以 0（對(duì)照）、5、10、20 μmol/L 劑量索拉非尼進(jìn)行處理，48 h后用增強(qiáng)型BCA蛋白測(cè)定試劑盒分別提取并測(cè)定以上細(xì)胞株中總蛋白濃度；采用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS/PAGE）分離每個(gè)細(xì)胞株約30μg總蛋白，然后移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)抗β-肌動(dòng)蛋白、B7-H3、B7-H4蛋白等一抗，隨后偶聯(lián)山羊抗兔/HRP孵育，抗β-肌動(dòng)蛋白抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)負(fù)荷。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件（IBM，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)經(jīng)單因素方差分析后再以事后分析（Dunnet t檢驗(yàn)）進(jìn)一步比較不同組間差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)

WB法檢測(cè)顯示，所有人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)與正常人肝細(xì)胞株（HL-7702）相比，均顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖 1。

2.2 索拉非尼對(duì)人肝癌細(xì)胞株的抑制作用

在B7-H3和B7-H4蛋白高表達(dá)的所有肝癌細(xì)胞株中選擇最為明顯的 Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6等5種肝癌細(xì)胞株，探討索拉非尼對(duì)其表達(dá)的影響。在此實(shí)驗(yàn)之前，先用MTT比色法測(cè)定索拉非尼對(duì)這些人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒性，以確定索拉非尼對(duì)這些肝癌細(xì)胞株有抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)索拉非尼對(duì)上述5種肝癌細(xì)胞株均具有抑制作用，它們的半抑制濃度（IC50）值分別為14.56、9.14、9.46、17.21、9.29 μmol/L，見圖 2。

圖1 B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中表達(dá)

圖2 索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株抑制率

2.3 索拉非尼對(duì)B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)的影響

分別以5、10、20μmol/L劑量索拉非尼處理不同人肝癌細(xì)胞株（Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6）48 h后WB檢測(cè)顯示，不同人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)均較對(duì)照組明顯下調(diào)（P＜0.01），見圖 3、4。

圖3 索拉非尼對(duì)MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6中B7-H3蛋白表達(dá)影響

圖4 索拉非尼對(duì)Hep3B、BEL-7404、MHCC97H中B7-H4蛋白表達(dá)影響

3 討論

免疫應(yīng)答缺陷可能有助于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中通常起著較為重要的作用，其中共刺激配體CD80和CD86對(duì)機(jī)體啟動(dòng)和維持免疫反應(yīng)密切相關(guān)，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞中表達(dá)缺失被認(rèn)為是腫瘤免疫逃逸的主要原因之一［15］。誘導(dǎo)抑制性因子如細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4，CD152）和程序性細(xì)胞死亡分子-1（PD-1，CD279）在免疫細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中表達(dá)并與抑制性因子配體結(jié)合，往往能夠參與腫瘤發(fā)?。?6］。如今阻斷抑制性輔助因子間相互作用已成功地應(yīng)用于腫瘤治療［17］，阻斷免疫細(xì)胞中抑制性輔助因子及腫瘤細(xì)胞中抑制性輔助因子配體表達(dá)，可能是防止腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的重要方法。

B7-H4和B7-H3是B7蛋白家族中抑制性輔助因子配體，與活化T細(xì)胞免疫功能有關(guān)［18-19］。Northern印跡法測(cè)定發(fā)現(xiàn)B7-H4蛋白在胸腺、肺、脾臟轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)［20］，B7-H3蛋白廣泛在淋巴器官、肝臟、睪丸、子宮、肺、骨骼肌等轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)［21］。 B7-H4和B7-H3蛋白似乎只在細(xì)胞翻譯水平受限［22］。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)B7-H4和B7-H3蛋白在非小細(xì)胞肺癌中有表達(dá)［23］，也有研究報(bào)道B7-H4蛋白在人肝癌細(xì)胞株 BEL-7404 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)［24］。

索拉非尼是一種多激酶抑制劑，目前已廣泛應(yīng)用于肝癌治療［25］，其一方面能通過阻斷RAF/MEK/RAK等信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖，另一方面通過抑制血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）受體及VEGF因子抑制腫瘤血管生成，具雙重抗腫瘤作用。早在2008年，歐美國(guó)家便完成了索拉非尼SHARPⅢ期臨床試驗(yàn)，結(jié)果顯示索拉非尼可使晚期肝癌患者中位生存期延長(zhǎng)44%、中位疾病進(jìn)展時(shí)間（TTP）延長(zhǎng)74%、死亡風(fēng)險(xiǎn)降低31%［26］。以中國(guó)為主的亞太地區(qū)2009年完成OrientalⅢ期臨床試驗(yàn)，也顯示出與歐美國(guó)家相近的結(jié)果［27］。

然而，目前尙不清楚不同人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)情況及索拉非尼對(duì)不同人肝癌細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用。本研究結(jié)果顯示，B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B、BEL-7402、 BEL-7404、BEL-7405、QGY-7701、QGY-7703、SMMC-7721、MHCC97H、MHCC97L、HCCLM3、HCCLM6）中表達(dá)，與正常人肝細(xì)胞株HL-7702相比，均明顯上調(diào)（P＜0.01）；WB法和MTT比色法檢測(cè)顯示索拉非尼通過抑制B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)對(duì) Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6等人肝癌細(xì)胞株產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)；索拉非尼對(duì)Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 肝癌細(xì)胞株均有細(xì)胞毒活性，其 IC50值分別為 14.56、9.14、9.46、17.21、9.29μmol/L；與對(duì)照組相比，在分別加入 5、10、20μmol/L等不同劑量索拉非尼48 h后，Hep3B、BEL-7404、MHCC97H、HCCLM3、HCCLM6 等人肝癌細(xì)胞株中B7-H3和B7-H4蛋白表達(dá)均發(fā)生顯著下降（P＜0.01）。B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中過表達(dá)常見，因此認(rèn)為其可能影響腫瘤免疫逃逸，而降低B7-H3和B7-H4蛋白在肝癌組織中表達(dá)則可能是預(yù)防和治療肝癌的候選靶點(diǎn)之一。本研究發(fā)現(xiàn)B7-H3和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中均過表達(dá)，但其與不同類型肝癌之間的關(guān)系尚需更深入研究，以達(dá)到個(gè)性化治療目的。

本研究結(jié)論認(rèn)為，B7-H3蛋白和B7-H4蛋白在不同人肝癌細(xì)胞株中通常過表達(dá)，可對(duì)腫瘤免疫逃逸機(jī)制造成影響，可能為肝癌預(yù)防和治療提供一個(gè)新靶點(diǎn)。

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