高效液相色譜法測定碳酸飲料中苯甲酸和山梨酸的含量

廖 鵬

（成都理工大學材料與化學化工學院，四川 成都 610059）

0 引言

苯甲酸、山梨酸及其鹽用作食品防腐劑，廣泛應(yīng)用于日常食品。苯甲酸及其鈉鹽具有抗菌作用。通常情況下，苯甲酸被認為是安全的。然而，苯甲酸的長期攝入也可能與哮喘，蕁麻疹，代謝性酸中毒及其他不良反應(yīng)有關(guān)，包括嬰兒和兒童[1]。山梨酸（鉀）可以有效抑制霉菌等細菌的活性，并且比殺菌更有效抑制細菌生長，有效延長食品的保存期限。隨著我國食品工業(yè)的發(fā)展，在食品加工過程中對食品防腐劑需求日益增長，一些商人為追求更高的利潤，甚至過量添加食品防腐劑。有資料表明過量使用苯甲酸和山梨酸可引起再生障礙性貧血，粒狀細胞缺乏[2]。因此，國家嚴格限制其使用量。

目前，苯甲酸、山梨酸的測定方法主要有氣相色譜法[3]、高效液相色譜法[4]、離子色譜法[5]、紫外分光光度法[6]等方法。高效液相色譜（HPLC）是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，引入氣相色譜法，高壓泵，高效固定相和高靈敏度檢測儀等先進技術(shù)，具有分析速度快，分離效率高，靈敏度高，操作自動化，應(yīng)用范圍廣等特點[7]。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀（LC-20A，日本島津股份有限公司）；DZKW-S-8電熱恒溫水浴鍋（北京光明醫(yī)療儀器廠）；電子分析天平（DT200，成都俊鴻達科技有限公司）；甲醇（色譜純）；乙酸銨溶液（0.02 mol/L）：稱取 1.54 g 乙酸銨，加水至 1000 mL溶解后經(jīng) 0.45 μm 濾膜過濾；稀氨水（1+1）：氨水和水等體積混合；碳酸氫鈉溶液（20 g/L）：稱取2 g碳酸氫鈉（優(yōu)級純），加水至100 mL后振搖溶解；苯甲酸、山梨酸標準品；碳酸飲料樣品：芬達橙味汽水（瓶裝600 mL）。實驗用水均為超純水。

1.2 標準溶液的配制

苯甲酸標準溶液：準確稱取0.1000 g苯甲酸，加碳酸氫鈉溶液（20 g/L）5 mL，加熱溶解，定容至100 mL，苯甲酸含量為1.0 mg/mL。山梨酸標準溶液配制同苯甲酸。

苯甲酸、山梨酸標準混合溶液：取苯甲酸、山梨酸標準溶液各10.0 mL至100 mL容量瓶中。溶液含苯甲酸、山梨酸標準溶液各0.1 mg/mL。經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾。

1.3 色譜條件

色譜柱為 Thermo-C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為 1.54 g/L 的乙酸銨-甲醇（體積比 85：15），流速為 1.0 mL/min，檢測波長為230 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。

1.4 樣品前處理

碳酸飲料：在電子分析天平上準確稱取碳酸飲料樣品兩份于小燒杯中，質(zhì)量分別為m1=8.0100 g；m2=8.0403 g，經(jīng)恒溫水浴鍋加溫攪拌除去二氧化碳，用氨水（1+1）調(diào)節(jié)pH≈7。加水定容體積V為50 mL。經(jīng)微孔過濾膜（0.45 μm）過濾后，濾液待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇

流動相會影響色譜組分的分離分析過程，是色譜分析中分離的一個非常重要的調(diào)節(jié)因素，正確地選擇流動相將直接影響到組分的分離度與靈敏度[8]。本實驗用甲醇—乙酸銨溶液（1.54 g/L）考察在甲醇—乙酸銨溶液不同比例下 （5∶95、10∶90、15∶85）各種物質(zhì)的分離情況，發(fā)現(xiàn)在甲醇—乙酸銨體積比為85∶15時效果最佳，各物質(zhì)間能很好地分離，分離效果較好，基線比較平穩(wěn)。故本實驗采用此流動相體系對樣品進行測定。

2.2 柱溫的選擇

柱溫直接影響分離效能和分析速度，柱溫過高會使各組分的揮發(fā)度靠攏，保留值差別縮小，不利于分離，所以從分離的角度考慮，宜采用較低的柱溫。但柱溫太低，被測組分在兩相中的擴散速率減小，分配不能迅速達到平衡，峰形變寬，柱效下降，并延長了分析時間。實驗時考察了不同柱溫下（25℃、30℃、35℃ ）各峰的分離情況，結(jié)果表明，在30℃的條件下，各峰的分離效果最佳，故選擇30℃為柱溫。

2.3 檢測波長的選擇

用紫外可見光分光光度計測量苯甲酸、山梨酸在200～400 nm下的吸光度A，根據(jù)相關(guān)文獻記載[9]，苯甲酸、山梨酸最大吸收峰的波長為225 nm，254 nm。本實驗對230 nm、240 nm、254 nm三個波長進行試驗，發(fā)現(xiàn)在波長230 nm下苯甲酸和山梨酸均有較理想的吸收，因此本實驗選用230 nm作為檢測波長。在該條件下對苯甲酸和山梨酸標準溶液進行色譜分析。

2.4 色譜圖

取1.2配制的苯甲酸、山梨酸標準溶液，用1.4處理好的樣品1，樣品2的溶液在1.3的色譜條件下進樣測定，分別得色譜圖如圖1、圖2和圖3所示。

圖1 苯甲酸、山梨酸的標準溶液色譜圖

圖2 樣品1的色譜圖

圖3 樣品2的色譜圖

2.5 標準曲線與檢出限

標準曲線的繪制：取10 mL的比色管，再分別加入苯甲酸、山梨酸的標準溶液（1.0 mg/mL）配制成濃度為 0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL、0.05 mg/mL的系列標準使用液。分別進樣10 μL，依次進行測定，繪制標準工作曲線，苯甲酸的線性關(guān)系方程為Y=464.15X-2.8831，山梨酸的線性關(guān)系方程為Y=824.91X-3.5755，均能得到良好的線性關(guān)系。苯甲酸和山梨酸在0.25～100 mg/L內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9970和0.9995。檢出限均為0.5 mg/L。

2.6 測定結(jié)果計算方法

式中：X—試樣中苯甲酸或山梨酸含量，g/kg；C—試樣檢測濃度，mg/mL；M—試樣質(zhì)量，g；V—試樣總體積，mL。

表1 樣品檢測結(jié)果

表1中：C1—樣品1苯甲酸檢測濃度，mg/mL；

C1｀—樣品 2苯甲酸檢測濃度，mg/mL；

C2—樣品1山梨酸檢測濃度，mg/mL；

C2｀—樣品 2山梨酸檢測濃度，mg/mL；

X1—樣品1中苯甲酸含量，g/kg；

X1｀—樣品 2中苯甲酸含量，g/kg；

X2—樣品1中山梨酸含量，g/kg；

X2｀—樣品 2中山梨酸含量，g/kg；

X1—2份樣品中苯甲酸的平均含量，g/kg；

X2—2份樣品中山梨酸的平均含量，g/kg；

2.7 加標回收率

按1.4預(yù)處理樣品，分別加入0.02 mg/mL，0.1 mg/mL濃度的苯甲酸、山梨酸標準混合溶液，平行測定2次，測定結(jié)果見表2。

3 結(jié)論

本實驗采用高效液相色譜法同時測定飲料中苯甲酸和山梨酸的含量，甲醇與乙酸銨的比例為15：85，柱溫：30℃。實驗結(jié)果表明各苯甲酸的加標回收率在 86.5%～105%之間，RSD＜3.8%，山梨酸的加標回收率在 99%～103.4%之間，RSD＜4.3%。采用不同濃度的系列混合標準溶液制作標準曲線，獲得較好的線性關(guān)系。該方法檢測苯甲酸和山梨酸的檢出限為0.5 mg/L?；厥章瘦^好，有較高的實用價值。

表2 苯甲酸山梨酸回收率

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