20 027例新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查的初步報告*

楊宇奇，蔣曙紅，韓小亞，江麗華，虞 斌，朱 偉

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇省常州市婦幼保健院實驗室 213003)

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是新生兒篩查領(lǐng)域最重大的進展之一[1-2]，可實現(xiàn)同時進行數(shù)十種代謝物分析，檢測出包括氨基酸、有機酸、脂肪酸氧化代謝紊亂在內(nèi)的多種遺傳代謝性疾病。本課題組已開展新生兒遺傳代謝病篩查工作15年，收到了很好的效果[3-4]。近年來，逐步拓展篩查病種，采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)一次檢測可篩查27種疾病，也收到了一定效果，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2015年4月至2016年12月在常州市婦幼保健院出生的新生兒，共20 027例(男10 665例、女9 362例)，年齡3～4 d，包括正常新生兒14 568例、早產(chǎn)兒(<37周)2 437例、低體重兒(<2 500 g)1 477例、巨大兒(>4 000 g)1 545例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準實施。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑 Waters AcquityTM TQD串聯(lián)質(zhì)譜儀、Waters 2777C自動進樣器、Waters 1525高效液相色譜儀泵由美國Waters公司提供；采用PerkinElmer公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒(NeoBase Non-derivatized MSMS Kit,美國PerkinElmer公司出品)進行篩查檢測，該試劑盒可檢測11種氨基酸，31種肉堿指標和1種酮類。

1.2.2標本采集 按照“新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范(2010版)”,出生后72 h、充分哺乳6次后，足跟采集4個血斑，懸空平置自然干燥成深褐色，塑料袋內(nèi)封口，在規(guī)定時間內(nèi)送至分中心實驗室，置4 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.2.3實驗操作 首先從濾紙片上打下3.2 mm左右的血斑放入V底微孔板，每孔加入100 μL內(nèi)標工作液，黏貼膜封板，孵育振蕩45 min，溫度45 ℃，轉(zhuǎn)速650～750 r/min，然后轉(zhuǎn)移75 μL至V型無包被潔凈微孔板，靜置2 h后上機檢測。

1.2.4可疑陽性的判讀 由兒科醫(yī)生結(jié)合臨床表現(xiàn)、生化代謝途徑等分析標本檢測值判讀出可疑陽性。首先原血片復(fù)查一次，如果復(fù)查結(jié)果和第一次結(jié)果一致進行召回復(fù)查；如果檢測值明顯高于截斷值的，立即召回復(fù)查。

1.2.5確診實驗 對篩查陽性的標本，根據(jù)其檢測值和臨床表現(xiàn)選擇做一些生化檢測如：血常規(guī)、肝腎功能、心肌酶譜、血氣、血糖、血氨、乳酸、丙酮酸等。對部分疑似氨基酸、有機酸代謝病加做尿氣相色譜(GC/MS)，對高度懷疑的遺傳代謝疾病做目標基因的檢測。

1.2.6隨訪與治療 所有陽性患兒均建立治療隨訪檔案。由于遺傳代謝病種類繁多且大多疾病較為罕見，尚未有統(tǒng)一的治療辦法，因此參照顧學(xué)范主編的《臨床遺傳代謝病》[5]對每種遺傳代謝病進行對癥治療。

2 結(jié) 果

2.1篩查一般情況 20 027例接收串聯(lián)質(zhì)譜篩查的新生兒中，電話召回重新采血復(fù)查237例，初篩陽性率為1.20%，初篩陽性召回率94.50%，經(jīng)召回復(fù)查檢測發(fā)現(xiàn)38例可疑陽性，篩查陽性率0.19%，最終確診8例，總陽性預(yù)測值為3.38%。見表1。

2.2確診陽性患兒情況 召回復(fù)查仍為陽性者結(jié)合生化檢測和基因檢測，最終確診新生兒遺傳代謝病8例(男4例，女4例)，總體發(fā)病率為1∶2 503，其中氨基酸代謝異常4例：分別為苯丙酮尿癥(PKU)2例、高甲硫氨酸血癥(MIM)1例、瓜氨酸血癥Ι型(CTLN1)1例；有機酸代謝異常4例：分別為戊二酸血癥Ι型(GA-1)2例、3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥(MCCD)1例、甲基丙二酸血癥(MMA)1例；尚未有確診的脂肪酸氧化代謝異常疾病。6例患兒(常見PKU病例除外)初篩檢測(串聯(lián)非衍生化法)、確診檢測及基因檢測結(jié)果見表2。

2.3篩查假陽性情況 整體篩查假陽性達1.16%，其中以篩查 脂肪酸氧化代謝障礙假陽性率最高，氨基酸代謝障礙其次，有機酸代謝障礙最低。在所檢測的43項指標中，游離肉堿(C0)、瓜氨酸(CIT)和酪氨酸(TYR)等指標的異常占總假陽性的比例較高，分別為43.4%、12.9%和6.8%。

表1 常州地區(qū)新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查整體情況

-:無數(shù)據(jù)

表2 8例確診患兒檢測結(jié)果

續(xù)表2 8例確診患兒檢測結(jié)果

2.4隨訪與治療 2例PKU患兒囑飲食控制，根據(jù)苯丙氨酸水平調(diào)整飲食，開始每周復(fù)查一次，待穩(wěn)定后延長復(fù)查時間(1月、2月、半年)。2例戊二酸血癥限制蛋白攝入、食用特殊奶粉以及通過左旋肉堿和維生素B12藥物治療，每3個月隨訪1次。1例高甲硫氨酸血癥和2例3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥不予特殊治療囑咐患兒定期隨訪。1例瓜氨酸I型血癥患兒，監(jiān)測血氨和血串聯(lián)，3月隨訪一次。7例患兒現(xiàn)生長發(fā)育良好。1例甲基丙二酸患兒出生1周后因新生兒肺炎入院治療出現(xiàn)急性代謝紊亂，家屬要求放棄治療，患兒死亡。

3 討 論

眾所周知，新生兒疾病篩查是重要的出生缺陷防治三級預(yù)防手段，在提高兒童健康方面發(fā)揮了巨大作用。近年來，新篩技術(shù)的不斷進步，不僅提高了篩查工作的效率，同時也降低了臨床的漏診率和誤診率。一些發(fā)達國家早在上世紀90年代初就開展了串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)技術(shù)進行遺傳代謝病的篩查[6]，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已經(jīng)成為新生兒疾病篩查最重大的發(fā)展之一。

本課題組自2015年開始采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于常州地區(qū)新生兒遺傳代謝病的篩查，至今篩查了20 027例，發(fā)現(xiàn)了8例陽性患兒，總發(fā)病率為1∶2 503，與報道的總體發(fā)病率1∶2 000大致相仿[7]，但明顯高于上海和浙江等地。8例陽性病人中4例為氨基酸代謝病、4例為有機酸代謝病，尚未確診發(fā)現(xiàn)脂肪酸氧化代謝病例，可能與脂肪酸氧化代謝障礙發(fā)病率低且篩查例數(shù)尚少，開展的區(qū)域比較局限有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，新生兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查總的陽性預(yù)測值為3.38%，氨基酸陽性預(yù)測值為5.13%，有機酸代謝9.50%，與美國研究結(jié)果較為接近[8]。筆者發(fā)現(xiàn)因氨基酸異常召回的假陽性中，異常的指標主要集中在CIT和TYR上，其中CIT占了假陽性的12.90%、TYR占了6.80%。同時在召回復(fù)查的過程中發(fā)現(xiàn)因TYR偏高而召回的初篩陽性者均存在黃疸較高或為早產(chǎn)兒的情況，尤其是召回復(fù)查的早產(chǎn)兒均有不同程度的TYR增高，這與許多文獻報道[9-10]早產(chǎn)兒、低體重兒和黃疸患兒體內(nèi)某些氨基酸會有升高或降低的現(xiàn)象相符合。這可能是由于早產(chǎn)或(和)低體重兒因機體各器官發(fā)育不成熟，機體的正常代謝機制亦尚未完善；同時由于一些氨基酸與肝臟的受損和修復(fù)相關(guān)，在修復(fù)的過程中氨基酸會有升高的現(xiàn)象，所以在這些早產(chǎn)兒、低體重兒、黃疸患兒中會有氨基酸異常升高的情況。CIT異常多因偏低召回，但未有文獻報道何種原因會導(dǎo)致血片中的CIT偏低。有文獻證明血片的質(zhì)量影響實驗結(jié)果[11-12]，筆者在總結(jié)日常工作經(jīng)驗中也發(fā)現(xiàn)在某些采血不規(guī)范的情況下會造成CIT偏低，具體情況有待進一步探察研究。在20 027例標本中未發(fā)現(xiàn)1例脂肪酸氧化代謝異常，但因肉堿指標異常召回的占了假陽性的71.50%，其中C0偏低占假陽性43.40%，C3偏高占11.80%。新生兒體內(nèi)的C0和C3受體重、胎齡、黃疸以及母源性缺乏和季節(jié)變化等影響因素較多[9,12-15]，本課題組統(tǒng)一在嬰兒出生后72 h采血，有時候無法完全避免這些影響因素，這可能是導(dǎo)致脂肪酸氧化代謝病的假陽性過高的主要原因。

本研究顯示串聯(lián)檢測雖然敏感性高，但是假陽性率亦高。如何降低假陽性率減少召回人數(shù)，降低一些初篩陽性新生兒家長的焦慮是急切要做的事情。課題組開展串聯(lián)項目之初采用的是結(jié)合了浙江兒童醫(yī)院近80萬篩查數(shù)據(jù)分析和國內(nèi)權(quán)威專家的數(shù)據(jù)解讀經(jīng)驗設(shè)定的參考范圍。遺傳代謝病的發(fā)病率因地域和人種而不同，同時許多研究表明早產(chǎn)、低體重兒存在腸道外營養(yǎng)都會影響氨基酸及酰基肉堿濃度變化，不同出生體重標記物的截斷值也可能不同。因此需要參考胎兒的體重、胎齡、是否黃疸、采血時間等來設(shè)定截斷值，隨著臨床判讀經(jīng)驗的不斷累積也要相應(yīng)的去優(yōu)化截斷值，從而提高陽性預(yù)測值，降低假陽性率。

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