毛細管區(qū)帶電泳測定大黃提取物中有效成分的含量*

曾 雪，楊元娟，陳 竹，劉應(yīng)杰，夏培元

(1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 401331；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科，重慶 400050；3.重慶市藥物制劑工程技術(shù)研究中心 401331；4.重慶市食品藥品檢驗檢測研究院 401121；5.重慶市化學(xué)藥品質(zhì)量控制與評價協(xié)同創(chuàng)新中心 401121)

藥用大黃是我國常用中藥，具有多種藥理作用[1-3]。有效成分的檢測方法主要有紙色譜法、柱色譜法(HPLC)[4]、薄層色譜法[5]和高效液相色譜法[6-8]，但液相色譜操作過程復(fù)雜，流動相處理要求高，試劑消耗量大。高效毛細管電泳(high performance capillary electrophoresis,HPCE)是一種具有靈敏度和分辨率高、成本較低的分離分析技術(shù)[9-10]。本研究以大黃為對象，回流提取有效成分，并采用高效毛細管電泳作為分離和檢測手段，通過加入β-環(huán)糊精和調(diào)節(jié)緩沖溶液pH實現(xiàn)更好分離效率，該方法國內(nèi)尚無相關(guān)研究，是液相色譜法的一個有力補充[11-13]。

1 材料與方法

1.1材料 CL1020高效毛細管電泳儀(紫外檢測器，北京彩陸儀器有限公司，中科院研究生院應(yīng)化所，中國)，GWA-UN1型超純水器(北京普析通用儀器有限公司，中國)，SK-1渦旋混合器(常州市國旺儀器制造有限公司，中國)，AUX220電子天平(島津,日本)。Na2B4O7·10 H2O(分析純，重慶北碚精細化工工廠)；無水碳酸鈉(分析純，重慶北碚精細化工工廠)；羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD，相對分子量1 459.8，ACROS ORGANICS,New Jersey,USA)；大黃素(C15H10O5，批號must-14110704)、大黃酚(C15H10O4，批號must-14072415)和大黃酸(C15H8O6，批號must-14072401，HPLC純度大于或等于98.0%)對照品(美侖生物科技有限公司，中國)，藥用大黃飲片(四川省阿壩州松潘縣藥用大黃栽培基地)，其他試劑均采用分析純。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備 精密稱取大黃素對照品、大黃酸對照品和大黃酚對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含大黃酸、大黃素、大黃酚各8.0 mg的對照品貯備液；分別精密量取上述對照品貯備液各2 mL，定容至10 mL,混合搖勻，即得(每1 mL中大黃素、大黃酸、大黃酚各1.6 mg)。

1.2.2供試品溶液的制備 取藥用大黃飲片粉碎，取粉末(過四號篩)約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，置燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理5 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[14-15]。

1.2.3電泳條件

1.2.3.1毛細管預(yù)處理 采用67.4 cm×75.0 μm石英毛細管柱(有效長度51.0 cm，河北永年瑞豐色譜配件有限公司)為分離柱，毛細管分別用0.1 mol/L NaOH沖洗活化10 min，水洗5 min，再用緩沖溶液沖洗5 min。每次進樣前都分別用0.1 mol/L NaOH沖洗3 min，水洗1 min，再用緩沖溶液沖洗2 min，以保證遷移時間和峰面積的重現(xiàn)性。

1.2.3.2電泳條件設(shè)定 分離電壓范圍：15～30 kV，進樣方式采用壓差進樣，進樣時間5 s，操作溫度25 ℃，緩沖溶液：60 mmol/L Na2B4O7+40 mmol/L Na2CO3+40 mmol/L HP-β-CD(pH 8.9)；供試品緩沖溶液與此相同。

2 結(jié) 果

2.1電泳條件優(yōu)化

2.1.1檢測波長的選擇 大黃素和大黃酸的吸收波長均在250～270 nm處，其中254 nm為最大吸收波長。大黃酚在254、530 nm處有最大吸收，依據(jù)中國藥典2015版，均采用254 nm為檢測波長，因此本實驗采用254 nm波長為檢測波長。

2.1.2進樣方式的選擇 毛細管電泳的進樣方式對分離效率和重現(xiàn)性有重要影響，壓力進樣和電動進樣為最常見的兩種進樣方式，電動進樣對粘度較大的生化樣品比較適合，但測量重現(xiàn)性較差，且可能因各組分擴散系數(shù)的差別而導(dǎo)致遷移速率的改變，本試驗的標本為大黃提取物，相對生化樣品粘度較低，且注重重現(xiàn)性，因此選擇壓力進樣作為進樣方式。采用進樣壓力0.5 psi，進樣實踐0.5 s。

2.1.3緩沖溶液及濃度的優(yōu)化 由于大黃素、大黃酚和大黃酸的結(jié)構(gòu)近似，電荷差異小，且大黃提取中成分較多，采用區(qū)帶電泳分離模式(CZE)較難實現(xiàn)3種目標組分的完全分離，因此本試驗通過在緩沖體系中加入低濃度HP-β-CD，在傳統(tǒng)的CZE電泳模式下引入膠束電色譜模式，利用3組分在分配系數(shù)上的差異，當(dāng)HP-β-CD濃度達到40 mmol/L時，實現(xiàn)完全分離，見圖1、2。

A:大黃素；B:大黃酚；C:大黃酸

圖1大黃主要活性成分結(jié)構(gòu)式

2.2方法學(xué)驗證

2.2.1精密度試驗 精密量取“1.2.1”項下對照品溶液，按“1.2.3.1”項下電泳條件連續(xù)進樣測定3次，記錄峰面積。大黃素、大黃酚和大黃酸相對標準偏差(RSD)分別是 1.79%、4.46%和2.30%，表明儀器精密度良好，見表1。

2.2.2線性范圍 分別精密吸取“1.2.1”項下大黃素、大黃酚和大黃酸對照品溶液2 mL于10 mL容量瓶中定容，配置成濃度為1.6 mg/mL對照品溶液，再分別吸取對照溶液0.3、0.8、1.3、1.8、2.3、2.8 mL，置于6個10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，搖勻，得等濃度梯度對照品溶液，并分別以“1.2.3”項下電泳條件進行電泳分析檢測，分別以3組分對照品濃度為橫坐標(X)，以對照品峰面積為縱坐標(Y)進行回歸計算，得到大黃素回歸方程為：Y=0.079 4X-0.034 6，r=0.995 7；大黃酚回歸方程為：Y=0.085 3X-0.042 8,r=0.995 9；大黃酸回歸方程為：Y=0.078 4X-0.073 2,r=0.995 4，鑒于壓力進樣存在一定誤差，3組分共同線性范圍在1.1～19.0 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3回收率試驗 精密稱取大黃樣品粉末約1.5 g，共3份，分別置于5個錐形瓶中，按“1.2.2”項下“大黃提取物供試品”方法制備供試品溶液，先按“1.2.3”項下電泳條件檢測并記錄每份樣品的電泳譜圖，再在每份供試品中加入等量的大黃素、大黃酚和大黃酸對照品各3 mg，再次測定其含量，分別計算大黃素、大黃酚和大黃酸的平均回收率，結(jié)果顯示該方法單組分回收率較好，多組分RSD偏高，分析可能是由于大黃提取物成分較多，且本方法是同時考察3組分在電泳中含量，目標組分間存在化學(xué)性質(zhì)差異，導(dǎo)致檢測效率不一致所致，見表2。

A:CZE 模式下CE分離檢測；B:HP-β-CD修飾后CZE模式下大黃混合標品CE分離檢測；C:HP-β-CD修飾后CZE模式下大黃提取物CE分離檢測

圖2 HP-β-CD修飾前后大黃毛細管電泳對比圖

表2 回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.3樣品含量測定 對3批樣品進行含量測定，分別精密稱取不同批次大黃藥材樣品粉末約1.5 g，按“1.2.2”項下“大黃提取物供試品”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”項下電泳條件進行電泳分離檢測，分別記錄大黃素、大黃酚和大黃酸含量，見表3。

表3 3批次樣品中大黃提取物的含量測定結(jié)果(n=3,%)

3 討 論

大黃素、大黃酚、大黃酸3組分化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，帶電差異小，CZE模式分離效果較差，本文加入HP-β-CD是因為環(huán)糊精分子略呈錐形的中空圓筒立體環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有一定的疏水性，增加了普通緩沖溶液的多相特性，待測組分在環(huán)糊精修飾的緩沖體系中，由于不同的疏水性而呈現(xiàn)出不同的分配系數(shù)，從而使不同組分在毛細管電泳中不僅受到電滲流的影響，同時也受到分配色譜的影響，有利于組分的完全分離。

電泳進樣方式對本方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性有很大影響，電動進樣操作簡便且進樣量穩(wěn)定，但更適合于粘度較大的生化樣品，而本文是中藥提取物且?guī)щ娦圆幻黠@，用電動進樣不利于樣品的導(dǎo)入，所以采用壓力進樣，保證了進樣的重現(xiàn)性。

方法學(xué)考察中含量測定的RSD偏高，分析原因是因為本方法優(yōu)先考慮大黃提取物多組分的分離度，在保證完全分離基礎(chǔ)上，犧牲了部分檢測準確度,導(dǎo)致結(jié)果RSD偏高，可在后期方法優(yōu)化上進一步改進。

通過β-環(huán)糊精修飾毛細管區(qū)帶電泳測定大黃提取物的方法分析速度快，緩沖溶液簡單，試劑消耗量少，可作為高效液相法的重要補充。

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