食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞與食管癌細(xì)胞相互作用的體外研究*

徐志彬，袁 麗，鄭秀麗，王士杰，吳明利

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)鏡科，石家莊 050011)

中晚期食管癌病死率高，無論是手術(shù)或是放化療，療效差、生存率低，目前仍無有效的藥物對(duì)其進(jìn)行防控。研究證實(shí)食管癌相關(guān)纖維母細(xì)胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)可分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，激發(fā)多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，腫瘤細(xì)胞亦能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變而活化。本項(xiàng)研究食管間質(zhì)內(nèi)正常間質(zhì)成纖維細(xì)胞(NFs)、不典型增生間質(zhì)成纖維細(xì)胞(AFs)及CAFs分別與食管癌細(xì)胞株ECa109間接共培養(yǎng)后4種細(xì)胞的生物學(xué)特性及部分基因表達(dá)的變化，分析食管癌細(xì)胞與食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞相互作用機(jī)制，研究可以阻斷傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，期盼提高實(shí)體腫瘤治療效果。

1 材料與方法

1.1材料 人食管癌ECa109細(xì)胞株購于中國科學(xué)院細(xì)胞中心。收集本院手術(shù)后正常食管組織、食管癌前病變及食管癌標(biāo)本各10例，分離、培養(yǎng)、純化而得食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞，細(xì)胞均凍存于本院科研中心。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將組織轉(zhuǎn)移入加好適量0.1%膠原酶Ⅱ液的培養(yǎng)瓶，置于37 ℃ 5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化，顯微鏡下見到細(xì)胞團(tuán)或獨(dú)立的細(xì)胞即可終止消化，收集細(xì)胞、過濾、離心、洗滌、離心、制備細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)、接種細(xì)胞，2～3 d換液1次，待細(xì)胞爬滿瓶底后，首次細(xì)胞傳代，再向培養(yǎng)瓶中加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)混合液，消化1 min，于倒置顯微鏡下觀察可見胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大，加入2 mL胎牛血清(FBS)培養(yǎng)基，終止消化，用吸管吹打瓶底，收集細(xì)胞、離心、洗滌、離心、細(xì)胞懸液、計(jì)數(shù)、接種培養(yǎng)。經(jīng)過3次傳代后，用第4代純化細(xì)胞做鑒定。

1.2.2細(xì)胞免疫化學(xué)染色(SP法) 于載玻片上固定細(xì)胞爬片，3% H2O2室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗5 min×3次，10% FBS封閉30 min，棄去封閉液，分別加入一抗[細(xì)胞角蛋白(CK)、波形蛋白(Vimentin)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)]，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，加入二抗，濕盒中孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，室溫下反應(yīng)10 min，PBS漂洗1 min×2次，蘇木素染色1 min，水洗10 min，95%乙醇脫水1～2 s，樹膠封片，用已知陽性細(xì)胞爬片做陽性對(duì)照，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，即可判定為陽性染色。

表1 引物序列和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度

β-actin:β-肌動(dòng)蛋白;TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長因子-β1；HGF：人肝細(xì)胞生長因子；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶；PCNA：增殖細(xì)胞核抗原

1.2.3反轉(zhuǎn)錄PCR 提取總的RNA：長滿細(xì)胞的75 mL培養(yǎng)瓶棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，加1 mL Trizol裂解細(xì)胞。將裂解細(xì)胞液移入離心管中，室溫靜置5 min，加入0.2 mL氯仿，劇烈震搖15 s，室溫靜置 2～3 min,4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，溶液分為3層，最上層無色液體含總RNA，移至另一干凈的離心管中，加入等量異丙醇，顛倒混勻，冰浴15 min，在4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min棄上清，加入75%乙醇1 mL震搖混勻后，在4 ℃ 7 500 r/min 離心5 min棄上清，室溫干燥5～10 min，加入20～30 μL無RNA 酶水，溶解后的RNA用紫外分光光度儀測定其A260/A280光密度比值(1.8～2.0之間較好)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 1 μg，Oligo(dT)15 Primer 1 μL，5×Reaction buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，Ribolock RNase inhibitor 1 μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1 μL，將以上試劑依次加入200 μL的PCR管中，補(bǔ)足無RNA裂解酶水至總體積達(dá)12 μL，以上均于冰上操作。將上述試劑混勻，置于PCR儀上，42 ℃孵育60 min，70 ℃孵育5 min，終止反應(yīng)。合成的cDNA可直接用于PCR反應(yīng)。引物序列全長選自Pubmed基因庫，引物序列是由上海英駿生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)及合成，在Genebank上核對(duì)證實(shí)引物序列和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度，見表1。

1.2.4NFs、AFs和CAFs對(duì)食管癌細(xì)胞株ECa109侵襲能力的影響 采用24孔Transwell小室(濾膜孔徑8.0 μm，濾膜直徑6.5 mm)構(gòu)建細(xì)胞交互作用模型。上室底部濾膜預(yù)先鋪蓋 Matrigel以模擬基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，具體步驟為：Matrigel 4 ℃過夜解凍，DMEM培養(yǎng)基1∶10稀釋后，迅速加入上室，每孔加100 μL，冰上完成，所用器具均已經(jīng)預(yù)冷。將鋪蓋了 Matrigel的小室放于37 ℃恒溫箱保溫 6 h，將200 μL食管癌ECa109細(xì)胞株(濃度1.5×105個(gè)/mL)等量接種于凝膠上，下室分為3組，每組等體積(600 μL)加入含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基(對(duì)照)及濃度為 5×104個(gè)/mL的NFs、AFs和CAFs，每組設(shè)兩復(fù)孔，作用24 h，拭去上室的凝膠和細(xì)胞，Giemsa染色，二甲苯封片。顯微鏡下計(jì)數(shù)膜左、右、中、上、下5個(gè)視野的穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.5NFs、AFs和CAFs與食管癌ECa109細(xì)胞株的相互影響 ECa109細(xì)胞2×105個(gè)共600 μL接種于Transwell 6孔板的上室，細(xì)胞貼壁后，將等體積200 μL的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、NFs、AFs和CAFs細(xì)胞置入孔徑為0.4 μm 直徑的6.5 mm的Transwell小室的下室，培養(yǎng)24 h后，分離、提取上室的Eca109細(xì)胞，以備檢測腫瘤標(biāo)志性mRNA及PCNA mRNA。

2 結(jié) 果

2.1NFs、AFs和CAFs的鑒定 細(xì)胞免疫化學(xué)染色：NFs、AFs和CAFs中CK均為陰性，Vimentin為陽性。α-SMA在NFs中為陰性表達(dá)，在AFs和CAFs中為陽性表達(dá)，見圖1。

2.2NFs、AFs和CAFs的部分標(biāo)志性腫瘤mRNA測定 從NFs到AFs再到CAFs，Vimentin mRNA的表達(dá)無差別，α-SMA mRNA的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TGF-β1 mRNA、HGF mRNA、MMP2 mRNA和MMP9 mRNA在NFs、AFs中弱表達(dá)，在CAFs中高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見圖2。

2.3食管癌ECa109細(xì)胞株對(duì)NFs、AFs和CAFs部分腫瘤標(biāo)志性mRNA的影響 與食管癌ECa109細(xì)胞株間接共培養(yǎng)后，NFs、AFs中TGF-β1 mRNA、HGF mRNA、MMP2 mRNA、MMP9 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而CAFs在作用前后的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

A：CK 在NFs中的陰性表達(dá)(×100);B：Vimentin在NFs中的陽性表達(dá)(×400);C：α-SMA在NFs中的陰性表達(dá)(×400);D：CK 在AFs中的陰性表達(dá)(×100);E：Vimentin在AFs中的陽性表達(dá)(×400);F：α-SMA在AFs中的陽性表達(dá)(×400);G：CK 在CAFs中的陰性表達(dá)(×400);H：Vimentin在CAFs中的陽性表達(dá)(×400);I：α-SMA在CAFs中的陽性表達(dá)(×400)

圖1 NFs、AFs和CAFs 3種細(xì)胞關(guān)于CK、Vimentin、α-SMA的免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果

圖2 α-SMA、Vimentin、TGF-β1、HGF、MMP2、MMP9mRNA在NFs、AFs和CAFs中的表達(dá)

2.4NFs、AFs和CAFs對(duì)食管癌ECa109細(xì)胞株增殖的影響 NFs、AFs和CAFs分別與食管癌ECa109細(xì)胞間接培養(yǎng)后，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)食管癌ECa109細(xì)胞內(nèi)PCNA表達(dá)量顯著增加，AFs、CAFs能夠促進(jìn)ECa109細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而NFs對(duì)ECa109無明顯促增殖作用，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

NFs、AFs、CAFs:與食管癌ECaI09細(xì)胞株間接共培養(yǎng)后

圖3與食管癌ECa109作用后，NFs、AFs和CAFs中的TGF-β1、HGF、MMP2、MMP9 mRNA的表達(dá)

2.5NFs、AFs和CAFs對(duì)食管癌ECa109細(xì)胞株侵襲能力的影響 對(duì)照組見食管癌ECa109細(xì)胞株僅有少量細(xì)胞穿透Matrigel基膜，細(xì)胞數(shù)為(18.0±5.4)個(gè)，NFs作用下ECa109侵襲能力有所增強(qiáng)，到達(dá)濾膜下方的細(xì)胞數(shù)為(35.0±4.0)個(gè)，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AFs和CAFs作用下ECa109細(xì)胞株侵襲能力明顯增強(qiáng)，穿透Matrigel細(xì)胞數(shù)分別為(125.2±7.1) 、(135.5±8.0)個(gè)。AFs和CAFs組細(xì)胞侵襲能力與其他兩組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

1:Eca109;2:Eca109+NFs;3:Eca109+AFs;4:Eca109+CAFs

圖4 PCNA mRNA在Eca109細(xì)胞株及與NFs、AFs和CAFs作用后的Eca109細(xì)胞株中的表達(dá)

A:對(duì)照組;B:NFs組;C:AFs組;D:CAFs組

圖5侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×400)

3 討 論

腫瘤的生物學(xué)特性不僅受癌基因和抑癌基因的調(diào)控，還受間質(zhì)微環(huán)境的巨大影響。CAFs是腫瘤間質(zhì)微環(huán)境的主要細(xì)胞成分，在不同的組織器官，可以表達(dá)α-SMA[1-3]、成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)[4-6]等不同的特征性分子標(biāo)志。目前大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為，CAFs是由正常的成纖維細(xì)胞分化而來。已有研究證實(shí)，乳腺CAFs是由NFs轉(zhuǎn)化而來[7]，食管CAFs是否由NFs發(fā)展而來，兩者間是否存在過渡階段——AFs，食管癌細(xì)胞分別與NFs、AFs及CAFs相互作用后，雙方的生物學(xué)特性會(huì)發(fā)生怎樣的變化尚未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)NFs、AFs和CAFs的表型有差異，Vimentin表達(dá)均為陽性，NFs中α-SMA表達(dá)為陰性，而在AFs與CAFs中α-SMA表達(dá)均為陽性，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，三者α-SMA mRNA測定值間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，NFs基本不表達(dá)，AFs與CAFs均有表達(dá)，CAFs的α-SMA mRNA表達(dá)明顯強(qiáng)于AFs。三者的分泌表達(dá)能力也存在著差異，TGF-β1、HGF、MMP2和MMP9 mRNA的測定值呈現(xiàn)一個(gè)逐漸增高的趨勢，推測NFs活化成CAFs是一個(gè)漸進(jìn)的過程，AFs可能是一個(gè)過渡階段，活化的AFs與CAFs的蛋白分泌功能更為活躍。

癌細(xì)胞基因表型和生物學(xué)特性均可受到CAFs的影響。前列腺癌來源的CAFs和乳腺CAFs均能促進(jìn)具有癌變潛能的上皮細(xì)胞的惡變、增殖[8-9]。本研究顯示，食管NFs、AFs及CAFs均可促進(jìn)食管癌細(xì)胞株ECa109遷移侵和襲，AFs與CAFs還可促使該細(xì)胞株的PCNA表達(dá)明顯增強(qiáng)?？梢娀罨蟮拈g質(zhì)成纖維細(xì)胞可明顯促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，而NFs并未表現(xiàn)出抑制癌細(xì)胞的作用，反而是微弱刺激了癌細(xì)胞增殖，具體機(jī)制不明，推測可能與其表達(dá)少量TGF-β1或HGF有關(guān)。

癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞間的作用是交互的[10]，本研究顯示在與癌細(xì)胞ECa109非直接接觸后，NFs、AFs及CAFs的TGF-β1，HGF，MMP2和MMP9 mRNA表達(dá)均明顯增強(qiáng)，可見食管癌細(xì)胞可以誘導(dǎo)食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞的分泌功能變得活躍。過度表達(dá)TGF-β1或HGF的鼠纖維母細(xì)胞能夠誘導(dǎo)正常人乳腺上皮癌變[11]，雖然過度表達(dá)TGF-β1或HGF的人食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞可否誘導(dǎo)正常食管上皮細(xì)胞惡變尚無研究報(bào)道，但大量研究證實(shí)，CAFs可明顯促進(jìn)其他部位腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[12-14]。

綜上所述，食管CAFs可能是由NFs逐步發(fā)展而來，二者間的信號(hào)傳導(dǎo)通路復(fù)雜，切斷食管間質(zhì)成纖維細(xì)胞的促癌作用應(yīng)該是抑制食管癌進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。

[1]劉念，彭艷，鄭金華．口腔鱗癌侵襲方式與α-SMA、膠原纖維表達(dá)的相關(guān)性對(duì)預(yù)后的影響[J]．腫瘤學(xué)雜志，2016，22(9)：727-732．

[2]郭業(yè)兵，張廷國．α-SMA、MMP-2、bFGF在宮頸早期浸潤癌間質(zhì)中的表達(dá)及鑒別意義[J]．現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2016，25(12)：945-947．

[3]趙晶潔，李建華，王洪，等．乳腺癌中α-SMA蛋白與MMP-3蛋白的表達(dá)及其生物學(xué)行為[J]．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2015，31(5)：584-586．

[4]李長平，蓋曉東．子宮頸浸潤性癌組織中α-SMA和FAP表達(dá)及臨床意義[J]．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2015，31(11)：1248-1252．

[5]崔演，劉勝男，孫鳳丹，等．食管鱗癌間質(zhì)組織中FAP、CD68的表達(dá)及意義[J]．臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2014，30(1)：82-84．

[6]鄭芳，劉洪羽，李春紅，等．FAP、整合素α3β1和uPAR在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J]．哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，46(6)：546-549．

[7]POLYAK K,KALLURI R.The role of the microenvironment in mammary gland development and cancer[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2010,2(11):a003244.

[8]OLUMI A F,GROSSFELD G D,HAYWARD S W,et al.Carcinoma-associated fibroblasts direct tumor progression of initiated human prostatic epithelium[J].Cancer Res,1999,59(19):5002-5011.

[9]蔡偉，康驊，劉晨，等．CAFs對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及機(jī)制探討[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22(6)：1249-1253．

[10]REN J,GUO H,WU H L,et al.GPER in CAFs regulates hypoxia-driven breast cancer invasion in a CTGF-dependent manner[J].Oncol Rep,2015,33(4):1929-1937.

[11]KUPERWASSER C,CHAVARRIA T,WU M,et al.Reconstruction of functionally normal and malignant human breast tissues in mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(14):4966-4971.

[12]鮑健，吳正升，齊越，等.乳腺癌組織中TGF-β1的表達(dá)及其介導(dǎo)乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制[J].中華腫瘤雜志，2009,31(9):679-682.

[13]WANG J,CHEN J,ZHANG K L,et al.TGF-β1 regulates the invasive and metastatic potential of mucoepidermoid carcinoma cells[J].J Oral Pathol Med,2011,40(10):762-768.

[14]GONZALEZ-ZUBELDIA I,DOTOR J,REDRADO M,et al.Co-migration of colon cancer cells and CAFs induced by TGFβ enhances liver metastasis[J].Cell Tissue Res,2015,359(3):829-839.