荷芪散對多囊卵巢綜合征大鼠內(nèi)分泌代謝及PI3K/AKT信號通路的影響

趙恒俠，周道成，李惠林，張世茂，劉 媛，鄭夏潔，陳 哲，張 卓

(1. 廣東省深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033；2. 廣州中醫(yī)藥大學第四臨床醫(yī)學院，廣東 深圳 518033)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是以多病因和臨床表現(xiàn)極不均一為主要特征的一種常見內(nèi)分泌代謝綜合征，至今病因和發(fā)病機制仍不明確。其典型的臨床表現(xiàn)為不同程度的月經(jīng)異常、不孕、多毛、痤瘡、肥胖、卵巢多囊性改變等，并常伴隨胰島素抵抗(IR)、高血脂癥和高胰島素血癥等[1]。有研究表明，PCOS卵巢局部IR與miRNA表達異常導致的PI3K/AKT信號通路傳導障礙緊密相關(guān)[2]。荷芪散是自擬經(jīng)驗方，具有填精固腎、醒脾祛濕、行氣化痰等功效，用于治療多囊卵巢綜合征不僅可降糖調(diào)脂，還可調(diào)節(jié)性激素水平，改善卵巢形態(tài)。本研究旨在通過觀察荷芪散對PCOS大鼠模型糖脂代謝、性激素和卵巢形態(tài)以及PI3K/AKT信號通路基因表達量的影響，探討其可能的作用機制。

1 實驗資料

1.1動物及飼養(yǎng) 健康SPF級雌性SD大鼠60只，約21 d日齡，體質(zhì)量(200±10)g，均由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，標準實驗環(huán)境下飼養(yǎng)，自由攝水、攝食。普通飲水及基礎(chǔ)飼料由廣州永諾生物科技有限公司提供。

1.2主要藥品 ①荷芪散復方制劑由深圳市中醫(yī)院制備，由荷葉30 g、黃芪30 g、決明子30 g、山藥15 g、桃仁10 g、石菖蒲10 g、制何首烏15 g、法半夏10 g、紅花10 g、當歸15 g、冬瓜皮15 g、仙茅15 g、淫羊藿15 g、菟絲子15 g、甘草5 g組成。生藥由深圳市中醫(yī)院中藥房提供，并由深圳市中醫(yī)院制劑室協(xié)助煎煮、過濾，濃縮成含生藥8.1 g/mL的溶液。②二甲雙胍(商品名：格華止，中美上海施貴寶制藥有限公司)，用溫熱蒸餾水融化，并濃縮成含生藥0.135 g/mL的溶液。③注射用脫氫表雄酮(DHEA)由湖北遠成藥業(yè)公司提供，注射用油由浙江田雨山藥公司提供。

1.3主要試劑 血糖、血脂試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；空腹胰島素(FINS)、黃體生成素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)放免試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及PCR引物合成均由日本Takara公司提供。

1.4主要儀器及設(shè)備 旋渦振蕩器(海門市其林貝爾，vortex-5)，手提式高速分散器(寧波新芝，S10)，紫外可見分光光度計(上海奧譜勒儀器，UV-752P)，移液槍(Eppendorf)，電泳儀(Tanon，EPS300)，紫外透射分析儀(Hema,UV-3A)，電子天平(上海精密科學儀器，JA1003N)，實驗室pH計(METTLER TOLEDO)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇環(huán)宇科學儀器，HH-4)，冷凍高速離心機(Hema,TGL-16R)，手掌離心機(新莊醫(yī)療器械，XK-400)，冰箱(Siemens & Haier)，基因擴增儀(Hema，Hema9600)，Real-time Quantitative PCR(ABI，StepOne Plus)。

1.5分組、造模及干預 所有大鼠標準飼料適應性喂養(yǎng)2周后，隨機選出15只大鼠作為正常組，每日頸背部皮下注射油劑0.2 mL/100 g，連續(xù)4周；剩下45只大鼠每日頸背部皮下注射DHEA溶液(DHEA溶于注射用油劑，濃度為30 mg/mL)0.2 mL/100 g進行造模，連續(xù)4周。全部大鼠每周稱體質(zhì)量1次。第10周齡大鼠陰道開口，取陰道涂片連續(xù)觀察2個性周期(1個性周期為5 d)，觀察各組大鼠動情周期變化。全部大鼠于第12周齡稱體質(zhì)量，眼眶后靜脈取血、離心、分離血清，采用放射免疫法檢測血清T、FINS。以陰道涂片連續(xù)出現(xiàn)角化細胞、失去完整動情周期、血清T、FINS水平異常升高判定為造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組、荷芪散組，每組15只。正常組和模型組大鼠給予生理鹽水10 mL/(kg·d)灌胃，二甲雙胍組給予二甲雙胍濃縮液10 mL/(kg·d)灌胃，荷芪散組給予荷芪散溶液10 mL/(kg·d)灌胃，均連續(xù)灌胃8周，期間正常喂食，每周稱體質(zhì)量1次。

1.6血糖、血脂及性激素指標水平檢測 實驗結(jié)束時取血，酶學方法檢測空腹血糖(FPG)、TC、TG、LDL-C、HDL-C水平，放射免疫法檢測FINS、LH、FSH、T水平，按公式計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。

1.7卵巢組織HE染色 大鼠取血后處死， 每組中隨機取10只大鼠卵巢小塊薄組織(1 cm×0.5 cm×0.3 cm)于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。隨后經(jīng)70%，80%，90%，100%乙醇逐級脫水，脫水程序為70%乙醇15 min，80%，90%，95%乙醇中各30 min，100%乙醇2 h并重復1次。用25%，50%，70%，90%二甲苯-無水乙醇透化各1 h。將標本浸入熔融的石蠟中浸蠟4 h，用加溫的鑷子將浸蠟的組織放入熔蠟中包埋，調(diào)整材料位置，待其移浮于水面并完全聚合。于旋轉(zhuǎn)切片機上制備4 μm厚縱向切片，隨后進行常規(guī)的HE染色觀察卵巢組織。

1.8卵巢組織中PI3K/AKT信號通路傳導分子mRNA相對表達量檢測 每組余下大鼠完整取出雙側(cè)卵巢，去除表面的脂肪組織，置入液氮內(nèi)保存。RT-PCR法檢測卵巢組織中胰島素受體底物-1(IRS-1)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT-2(AKT-2)、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白因子-4(GLUT-4)、人第10號染色體缺失的磷酸酶(PTEN)mRNA相對表達量。用Applied Biosystems公司Prmier express軟件設(shè)計引物。IRS-1引物序列：上游為5’-GTCTCGTGGCTGGGTGGA-3’，下游為5’-GGGCTCGCAGAAGTTAGGTG-3’，長度106 bp；AKT-2引物序列：上游為5’-CCATCCTTGTGCCCGAGAC-3’，下游為5’-CACCAGTGGCACATGCAAAC-3’，長度167 bp；GSK-3β引物序列：上游為5’-GGTGAAAATGCTTGGGTCG-3’，下游為5’-TGAAGGCAGTCTGTCGTAATAGC-3’，長度176 bp；GLUT-4引物序列：上游為5’-GATCGGCTCTGAAGATGGGG-3’，下游為5’-GGAGGAAATCATGCCACCCA-3’，長度182 bp；PTEN引物序列：上游為5’-AGACCATAACCCACCACAGC-3’，下游為5’-CAGGGCCTCTTGTGCCTTTA-3’，長度143 bp。反應體系組成:板cDNA 0.5 μL,SYBR Green PCR MasterMix 10 μL,Ps、Pa各0.5 μL(10 μmol/L),滅菌雙蒸水補至20 μL。循環(huán)條件為:50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s。每次實驗均設(shè)置陰性對照。目標基因的相對表達量計算公式： 2-△△Ct=2-[(△Ct)Test-(△Ct)Control]。Ct目的為目標基因Ct值，Ct管家為管家基因Ct值。△Ct= Ct目的-Ct管家，表示各樣本目的基因相對管家基因的相對Ct值，△△Ct =(△Ct)Test-(△Ct)Control，表示處理組相對對照組進行歸化，2-△△Ct表示處理組相對對照組的相對表達量，表示目標基因相對表達倍數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠糖脂代謝指標比較 模型組FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C均明顯高于正常組(P均<0.05)，HDL-C水平明顯低于正常組(P<0.05)；荷芪散組、二甲雙胍組FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C均明顯低于模型組(P均<0.05)，而HDL-C變化不明顯(P>0.05)；荷芪散組FPG、FINS、HOMA-IR與二甲雙胍組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，TG、LDL-C均明顯低于二甲雙胍組(P均<0.05)，而TC明顯高于二甲雙胍組(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠性激素指標水平比較 模型組血清LH、LH/FSH、T均明顯高于正常組(P均<0.05)，F(xiàn)SH明顯低于正常組(P<0.05)；荷芪散組、二甲雙胍組血清LH、LH/FSH、T均明顯低于模型組(P均<0.05)；荷芪散組LH、LH/FSH、T均明顯低于二甲雙胍組(P均<0.05)，F(xiàn)SH明顯高于二甲雙胍組(P<0.05)。見表2。

2.3各組大鼠卵巢組織切片HE染色情況 光鏡下觀察正常組卵巢組織結(jié)構(gòu)正常，可見部分發(fā)育階段卵泡，卵泡內(nèi)可見蛋白性液體，黃體結(jié)構(gòu)正常，泡膜細胞層無增生現(xiàn)象,見圖1；模型組卵巢組織中卵泡囊性擴張，內(nèi)含卵泡液，黃體數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)疏松紊亂，泡膜細胞層出現(xiàn)明顯增生現(xiàn)象，見圖2；荷芪散組、二甲雙胍組卵巢組織中囊性卵泡明顯較模型組少，黃體數(shù)量增多，排列尚規(guī)則，增生的泡膜細胞層變薄，見圖3及圖4。

表1 各組大鼠糖脂代謝指標比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與二甲雙胍組比較，P<0.05。

表2 各組大鼠性激素指標水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與二甲雙胍組比較，P<0.05。

圖1 正常組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)

圖2 模型組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)

2.4各組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4、PTEN mRNA相對表達量比較 模型組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯低于正常組(P均<0.05)，PTEN mRNA相對表達量明顯高于正常組(P<

圖3 荷芪散組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)

圖4 二甲雙胍組大鼠卵巢組織切片HE染色(×100)

0.05)；荷芪散組、二甲雙胍組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯高于模型組(P均<0.05)，PTEN mRNA相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)；荷芪散組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯高于二甲雙胍組(P均<0.05)，PTEN mRNA相對表達量明顯低于二甲雙胍組(P<0.05)。見表3。

3 討 論

表3 各組大鼠卵巢組織相關(guān)基因相對表達量比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與二甲雙胍組比較，P<0.05。

PCOS是一種因下丘腦-垂體-卵巢軸代謝紊亂引起機體代謝異常和生殖功能障礙的內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病和IR有非常緊密的聯(lián)系[3]。目前西醫(yī)對該病尚無特效療法，而中醫(yī)治療該病有一定優(yōu)勢。羅金等[4]研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖聯(lián)合達英-35可有效改善PCOS患者IR和高雄激素狀態(tài)及血脂代謝，并能使患者卵巢體積減小，停藥后大部分有規(guī)律月經(jīng)。相關(guān)臨床及實驗研究表明，活血化瘀和化痰藥具有促進盆腔微循環(huán)，增加子宮和卵巢血液供應，降低卵巢包膜厚度，促進排卵及黃體發(fā)育以及降低胰島素水平的作用[5-8]；補腎藥物可以通過調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢性腺功能，降低雄激素水平及改善IR，從而逆轉(zhuǎn)卵巢多囊樣改變[9-10]。

荷芪散為深圳市中醫(yī)院經(jīng)驗方，具有健脾祛濕、升清降濁、通便瘦身之效。方中黃芪補中益氣、健脾利水，為君藥；荷葉利濕化瘀，祛痰利水，升發(fā)清陽，為臣藥。決明子利水通便；制何首烏補肝益腎；山藥平補三焦，健脾益胃，填精固腎；冬瓜皮利水消腫；石菖蒲化痰瘀，消濕濁，利水濕；法半夏燥濕化痰，消痞散結(jié)；桃仁、紅花活血化瘀，通經(jīng)止痛；當歸活血調(diào)經(jīng)，補血止痛；仙茅、淫羊藿補腎助陽，祛風除濕；菟絲子補腎益精，養(yǎng)肝安胎，俱為佐使藥。全方共奏填精固腎、醒脾祛濕、行氣化痰之功,為脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)之首選。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，荷芪散可明顯降低肥胖患者體質(zhì)量，改善脂代謝，并且能減輕代謝綜合征患者胰島素和瘦素抵抗，糾正慢性炎癥狀態(tài)，提高胰島素敏感性[11-14]。該方臨床用于PCOS合并IR患者療效較好，能顯著改善IR和內(nèi)分泌紊亂。本實驗結(jié)果顯示，荷芪散組、二甲雙胍組FPG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、LH、LH/FSH、T均明顯低于模型組，且荷芪散組TG、LDL-C、LH、LH/FSH、T均明顯低于二甲雙胍組，而TC、FSH明顯高于二甲雙胍組；荷芪散組、二甲雙胍組大鼠卵巢組織接近正常。提示荷芪散可改善PCOS模型大鼠的糖脂代謝和卵巢組織形態(tài)，減輕IR，糾正性激素紊亂狀態(tài)。

目前研究表明IRS-1在相關(guān)信號傳導過程中優(yōu)先調(diào)節(jié)MAPK/ERK途徑，并通過激活轉(zhuǎn)錄因子增加細胞周期蛋白的基因表達，促進蛋白合成和細胞增殖[15]。磷酸化的IRSs導致二聚體構(gòu)象的改變，激活并活化PI3K，繼而形成PIP3，PIP3與蛋白激酶B(PKB)和重組人丙酮酸脫氫酶激酶同工酶-1(PDK-1)結(jié)合，最終活化AKT-2[16]。AKT是PI3K下游的直接靶蛋白，被PI3K激活后可以使GSK-3β發(fā)生磷酸化而失活，不能抑制糖原合成酶的活性，進而間接促進糖原合成；同時GSK通過減少IRS-1絲氨酸磷酸化，可抑制胰島素信號的傳導[17-19]。另外，在胰島素刺激下，靶細胞內(nèi)的GLUT-4由細胞內(nèi)的貯存室移位到細胞膜上，完成葡萄糖從細胞外向細胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)運[20]。PTEN是PI3K信號通路的負調(diào)節(jié)因子，可控制顆粒細胞的增殖，控制卵巢的正常排卵功能，能夠促進PIP3轉(zhuǎn)化為PIP2，抑制蛋白激酶AKT的表達，阻斷下游信號通路。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯低于正常組，PTEN mRNA相對表達量明顯高于正常組；荷芪散組大鼠卵巢組織中IRS-1、AKT、GSK-3β、GLUT-4 mRNA相對表達量均明顯高于模型組，PTEN mRNA相對表達量均明顯低于模型組。這說明多囊卵巢綜合征可能導致局部卵巢組織PI3K/AKT信號通路中相關(guān)重要信號傳導分子基因表達量的紊亂，而荷芪散可以重新上調(diào)IRS-1、AKT-2、GSK-3β、GLUT-4基因表達，下調(diào)拮抗因子PTEN基因表達。

綜上所述，荷芪散能通過上調(diào)局部卵巢組織PI3K/AKT信號通路中相關(guān)重要信號傳導分子如IRS-1、AKT-2、GSK-3β、GLUT-4的基因表達，下調(diào)拮抗因子PTEN的基因表達，改善PCOS模型大鼠糖脂代謝和卵巢組織形態(tài)，降低胰島素水平，減輕IR，糾正性激素紊亂狀態(tài)。

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