甘肅不同產(chǎn)地紅芪中總黃酮及總多糖含量測(cè)定研究

楊秀娟+楊志軍+牛鵬賢+潘子昱+邵晶+李碩

摘要：目的 建立甘肅不同產(chǎn)地紅芪中總黃酮及總多糖的含量測(cè)定方法。方法 采用紫外分光光度法，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葡萄糖為對(duì)照品，在波長(zhǎng)分別為260、484 nm處測(cè)定甘肅不同產(chǎn)地紅芪中總黃酮和總多糖的含量。結(jié)果 甘肅不同產(chǎn)地紅芪中總黃酮含量在2.82～6.79 mg/g之間，平均加樣回收率為97.96%；總多糖含量在106.14～746.40 mg/g之間，加樣回收率為102.90%。結(jié)論 甘肅不同產(chǎn)地紅芪中總黃酮、總多糖含量存在差異，采用紫外分光光度法測(cè)定紅芪中總黃酮、總多糖含量的方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠，可作為紅芪中總黃酮和總多糖的測(cè)定方法。

關(guān)鍵詞：紅芪；紫外分光光度法；毛蕊異黃酮苷；葡萄糖；總黃酮；總多糖

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.018

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）02-0079-04

Content Determination of Total Flavones and Polysaccharides in Hedysari Radix in

Different Producing Areas in Gansu Province

YANG Xiu-juan1， YANG Zhi-jun1，2， NIU Peng-xian1， PAN Zi-yu1， SHAO Jing1， LI Shuo1，2

1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese and Tibetan Medicine of Gansu Province， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To establish a method for content determination of total flavones and polysaccharides in Hedysari Radix in different producing areas in Gansu Province. Methods The contents of total flavones and polysaccharides in Hedysari Radix in different producing areas in Gansu Province were determined by ultraviolet spectroscopy with calycosin-7-glucoside and glucose as reference substance， and the wavelength was set at 260 nm and 484 nm. Results The contents were from 2.82 mg/g to 6.79 mg/g for total flavones and from 106.14 mg/g to 746.40 mg/g for total polysaccharides in Hedysari Radix in different producing areas in Gansu Province. The recoveries of total flavones and total polysaccharides were 97.96% and 102.90%， respectively. Conclusion There was difference in contents of total flavones and polysaccharides of Hedysari Radix in different producing areas in Gansu Province， and the method of using ultraviolet spectroscopy is simple， reproducible， accurate and reliable， which can be preferably used as the method for content determination of total flavones and polysaccharides in Hedysari Radix.

Keywords： Hedysari Radix； ultraviolet spectroscopy； calycosin-7-glucoside； glucose； total flavones； total polysaccharides

紅芪是豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz.的干燥根，其性微溫，味甘，歸脾、肺經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌功效[1]。紅芪最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》黃芪項(xiàng)下，并列為上品。在歷代本草文獻(xiàn)中，黃芪項(xiàng)下的“赤水耆”和“赤色者”即西北地區(qū)應(yīng)用歷史悠久的紅芪，并認(rèn)為紅芪是黃芪的優(yōu)良品種[2]。自1985年版《中華人民共和國(guó)藥典》開(kāi)始，將紅芪單列出來(lái)。

紅芪現(xiàn)主要分布在甘肅隴南、天水和定西等地區(qū)，一般被認(rèn)為是甘肅道地藥材，為甘肅十大隴藥之一，具有悠久的生產(chǎn)歷史。紅芪的化學(xué)成分主要有黃酮類(lèi)、皂苷類(lèi)、生物堿類(lèi)、氨基酸類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)及多糖及微量元素等。紅芪的藥理作用也比較廣泛，主要有提高免疫力、強(qiáng)心、利尿、抗病毒、抗自由基、抗腫瘤、抗炎、抗衰老、保肝、調(diào)節(jié)血糖和調(diào)節(jié)血脂作用[3-5]。endprint

本課題前期研究建立了甘肅不同產(chǎn)地紅芪的指紋圖譜，并采用一測(cè)多評(píng)法進(jìn)行了紅芪的含量測(cè)定[6]。本試驗(yàn)以葡萄糖和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為對(duì)照品，采用紫外分光光度法對(duì)甘肅10個(gè)產(chǎn)地11批紅芪中總黃酮及總多糖的含量進(jìn)行測(cè)定，比較甘肅不同產(chǎn)地紅芪中總黃酮、總多糖含量的差異，為紅芪質(zhì)量的整體評(píng)價(jià)控制及其資源的合理開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

UV Bluestar B紫外-可見(jiàn)分光光度儀（北京萊伯泰科技有限公司），電子天平（ALC-210.4，Acculab），十萬(wàn)分之一電子天平（BT 125D，德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），超聲清洗儀（SB25-12 DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司），循環(huán)水式真空泵（SHZ-DⅢ，鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司），干燥箱（101A-1，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）。

葡萄糖、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)分別為PY150812RM、PY150828RM，南京普怡生物科技有限公司，純度99%），無(wú)水乙醇（分析純），乙醇（分析純），雙蒸水。

11批紅芪樣品分別采自甘肅武都、隴西、甘谷和武山等10個(gè)產(chǎn)地，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李成義教授鑒定為豆科植物多序巖黃芪Hedysarum polybotrys Hand. -Mazz.的干燥根，樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮葡萄糖苷適量，加70%乙醇制成0.100 0 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液。取上述對(duì)照品溶液1、1.5、2、3、4 mL，分別置于25 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制得濃度分別為0.004 0、0.006 0、0.008 0、0.012 0、0.016 0 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品稀釋液。

精密稱(chēng)取105 ℃干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖適量，加蒸餾水制成0.100 0 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 總黃酮供試品溶液

取紅芪樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）約0.15 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率500/600 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 總多糖供試品溶液

取紅芪樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）約0.2 g，精密稱(chēng)定，用50 mL乙醇溶液浸泡，超聲提?。üβ?00/600 W，頻率40 kHz）2次，設(shè)置溫度為80 ℃，每次20 min（以去除單糖和低聚糖）；過(guò)濾后，將濾渣用50 mL蒸餾水超聲提?。üβ?00/600 W，頻率40 kHz）2次，每次20 min，合并2次濾液，移至100 mL量瓶中，將殘?jiān)盟礈?次，洗液并入量瓶中，定容，作為供試品溶液。精密吸取200 μL供試品溶液，加入蒸餾水1.8 mL、5%苯酚溶液1.0 mL，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后靜置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出，冷卻至室溫，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度[7-10]。

2.3 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取適中濃度毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葡萄糖對(duì)照品溶液及供試品溶液，在200～1000 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和紅芪總黃酮均在260 nm處有最大吸收，葡萄糖和紅芪總多糖均在484 nm處有最大吸收。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察

取“2.1”項(xiàng)下不同濃度毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液，用參比溶液調(diào)零，用適當(dāng)濃度對(duì)照品溶液在紫外區(qū)間（400～190 nm）進(jìn)行峰值檢測(cè)，總黃酮最大吸收峰在260 nm處。在260 nm處測(cè)定各對(duì)照品溶液吸光度（A），以毛蕊異黃酮葡萄糖苷濃度（C）為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=52.36C+0.007，r=0.999 9（n=6）。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.004～0.016 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

精密吸取“2.1”項(xiàng)下葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL置于10 mL試管中，分別加水至1.0 mL，另取一試管作為空白對(duì)照，加水1.0 mL，分別加5%苯酚1.6 mL，搖勻，然后快速滴加濃硫酸7.0 mL，搖勻后靜置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出后冷卻至室溫，于484 nm處測(cè)定各對(duì)照品溶液吸光度，以濃度對(duì)吸光度進(jìn)行回歸。以濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=11.20C-0.022，r=0.999 0（n=7）。結(jié)果表明，葡萄糖在0.020～0.080 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度考察

精密吸取濃度分別為0.008 0 mg/mL、0.100 0 mg/mL的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、葡萄糖對(duì)照品溶液，毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液按總黃酮線性關(guān)系考察方法在260 nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算得RSD=0.78%，葡萄糖對(duì)照品溶液顯色后在484 nm波長(zhǎng)處重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算得RSD=0.32%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性考察

分別精密稱(chēng)取同一產(chǎn)地（武都）紅芪樣品粉末6份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備總黃酮和總多糖供試品溶液，分別在260、484 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果總黃酮平均含量為3.68 mg/g，RSD=0.49%，總多糖平均含量為300.02 mg/g，RSD=1.29%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性考察

精密吸取同一產(chǎn)地（武都）紅芪供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h在260 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得總黃酮含量的RSD=0.92%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。endprint

2.4.5 顯色穩(wěn)定性考察

精密吸取顯色后葡萄糖對(duì)照品溶液、顯色后同一產(chǎn)地（武都）紅芪供試品溶液，分別于0、15、30、45、60、90、120 min在484 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得顯色后葡萄糖對(duì)照品溶液及供試品溶液的RSD分別為1.98%、1.26%，表明顯色后的對(duì)照品溶液和供試品溶液在2 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)定的樣品6份，每份0.075 g，分別加入一定量的對(duì)照品溶液（0.100 0 mg/mL），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按260 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果總黃酮的加樣回收率分別為97.57%、98.51%、98.30%、96.83%、98.76%、97.81%，平均加樣回收率為97.96%，RSD=0.72%，表明本方法的準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表2。

精密稱(chēng)取已測(cè)定的樣品6份，每份0.1 g，分別加入一定量的對(duì)照品溶液（0.100 0 mg/mL），按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在484 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果總多糖的加樣回收率分別為96.21%、98.39%、100.19%、99.50%、96.79%、98.00%，平均加樣回收率為98.18%，RSD=1.56%，表明本方法的準(zhǔn)確度良好，見(jiàn)表3。

2.5 樣品含量測(cè)定

取甘肅不同產(chǎn)地紅芪樣品粉末（過(guò)2號(hào)篩）約0.15～0.2 g，精密稱(chēng)定，按“2.2”項(xiàng)下方法制備總黃酮和總多糖供試品溶液，并分別按上述“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，分別在260 nm和484 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，將所測(cè)得的吸光度值代入回歸方程，計(jì)算總黃酮和總多糖含量，每份樣品平行3份，取其平均值。結(jié)果見(jiàn)表4、圖1、圖2。

3 討論

本試驗(yàn)采用紫外分光光度法對(duì)紅芪總黃酮的檢測(cè)過(guò)程進(jìn)行摸索，參照文獻(xiàn)[11-13]，選用芒柄花苷和毛蕊異黃酮苷2個(gè)對(duì)照品，在200～1000 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在相近濃度的情況下，毛蕊異黃酮葡萄糖苷吸光度明顯大于芒柄花苷吸光度。說(shuō)明毛蕊異黃酮苷在波長(zhǎng)260 nm處吸收更強(qiáng)，故選擇毛蕊異黃酮葡萄糖苷為含量測(cè)定對(duì)照品。在制備紅芪總黃酮供試品溶液的過(guò)程中對(duì)樣品提取方法（回流和超聲）、提取溶劑（70%乙醇和甲醇）、提取時(shí)間（30、60、30 min，2次）進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，采用回流提取與超聲提取紅芪總黃酮含量相當(dāng)，考慮超聲提取方法簡(jiǎn)便、高效，故采取超聲提取工藝；采用70%乙醇提取略?xún)?yōu)于甲醇提取，提取時(shí)間為60 min。

紅芪中含有豐富的多糖，本研究采取紅芪樣品粉末先用乙醇溶液浸泡，再超聲提取，并將溫度設(shè)至80 ℃，濾渣再重復(fù)以上操作，最后轉(zhuǎn)移至量瓶中并定容，該方法能有效提取紅芪多糖。

紅芪為甘肅地產(chǎn)特色藥材，在甘肅隴南資源豐富，本試驗(yàn)收集了甘肅10個(gè)產(chǎn)地11批紅芪藥材，采用紫外分光光度法測(cè)定甘肅不同產(chǎn)地紅芪中總黃酮、總多糖的含量。結(jié)果表明，該測(cè)定方法穩(wěn)定、重復(fù)性好、可靠性高；紅芪中總黃酮含量在2.82～6.79 mg/g之間，不同產(chǎn)地樣品的含量有較大差異，其中武山、甘谷、岷縣產(chǎn)紅芪中總黃酮含量較高，禮縣產(chǎn)紅芪中總黃酮含量最低；紅芪中總多糖含量在106.14～746.40 mg/g之間，其中禮縣、渭源栽培、西和產(chǎn)紅芪中總多糖含量較高，而岷縣產(chǎn)者含量最低。

近年來(lái)，紅芪等補(bǔ)益類(lèi)藥材的研究應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注，其需求量逐年增加，紅芪的有效開(kāi)發(fā)利用具有重要的研究意義。本試驗(yàn)為紅芪的質(zhì)量綜合評(píng)價(jià)及控制提供了參考依據(jù)。紅芪不同產(chǎn)地質(zhì)量差異及其影響因素、質(zhì)量評(píng)價(jià)控制指標(biāo)的確定與其藥效的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究。

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