基于UPLC—Q—TOF/MS技術(shù)的桑葉化學(xué)成分快速識別分析

劉金玲+李文姣+王韌+李森+張雨恬+周晉+賀福元

摘要：目的 采用超高液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）方法對桑葉的化學(xué)成分進(jìn)行快速分析。方法 采用ACQUITY UPLC- Q-TOF/MS聯(lián)用儀，以乙腈-水（含0.1%甲酸）為流動相梯度洗脫，流速0.3 mL/min，電噴霧離子源負(fù)離子模式采集檢測，以Masslynx4.1軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果 根據(jù)質(zhì)譜所提供的保留時間、精確相對分子質(zhì)量及二級質(zhì)譜裂解碎片信息并結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行分析，共鑒定和推測了桑葉中19種化學(xué)成分。結(jié)論 該方法可快速、靈敏、全面地分析桑葉的化學(xué)成分，為探討桑葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桑葉；超高液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜；化學(xué)成分；黃酮

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.02.016

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）02-0069-05

Fast Identification Analysis on Chemical Constituents in Mori Folium

by Using UPLC-Q-TOF/MS Method

LIU Jin-ling1，2， LI Wen-jiao1，2， WANG Ren1，2， LI Sen1，2， ZHANG Yu-tian1，2， ZHOU Jin1，2，3， HE Fu-yuan1，2，3

1. Pharmacy College， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. Laboratory of Supramolecular Mechanism and Mathematic-Physics Chracterization for Chinese Materia Medica， Changsha 410208， China； 3. Hunan Key Laboratory of Druggability and Preparation Modification for Traditional Chinese Medicine， Changsha 410208， China

Abstract： Obejective To conduct fast identification analysis on chemical constituents of Mori Folium UPLC-Q-TOF/MS method. Methods ACQUITY UPLC-Q-TOF/MS spectrometer was used， acetonitrile and water （containing 0.1% formic acid） as mobile phase with gradient elution. The flow rate was 0.3 mL/min， with ESI negative ion mode detection， data analysis with Masslynx4.1 software. Results According to the retention time provided by the mass spectrometry， the exact molecular weight and the secondary mass spectrometry were used to analyze the fragments by referring to literature， and 19 chemical constituents of Mori Folium were identified and deduced. Conclusion The method can analyze the chemical constituents of Mori Folium rapidly， sensitively and comprehensively， and provide the basis for the study of the pharmacological basis of Mori Folium.

Keywords： Mori Folium； UPLC-Q-TOF-MS； chemical constituents； flavonoids

桑葉為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉，分布于全國各地，性寒，味甘、苦，歸肺、肝經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目功效[1]。桑葉主要含有黃酮類化合物、綠原酸、甾體、三萜類化合物及微量揮發(fā)油等成分[2-4]，且黃酮類化合物占桑葉干重的

1%～3%，是莖葉中黃酮含量較高的植物。目前已有蘆丁、異槲皮苷、綠原酸等成分的研究，為了明確桑葉的藥效活性物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，有必要全面分析桑葉的化學(xué)成分。

近年來，超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)結(jié)合了超高液相的高分離度和高分辨率質(zhì)譜的高準(zhǔn)確、靈敏性，可快速提供各色譜峰的質(zhì)譜碎片信息，且可提供化合物的精確分子質(zhì)量信息，相對誤差<5×10-6，以及二級特征裂解碎片離子信息。即使在缺乏對照品的情況下，也可通過分析質(zhì)譜峰的質(zhì)譜信息或?qū)Ρ任墨I(xiàn)數(shù)據(jù)實現(xiàn)復(fù)雜體系中化學(xué)成分的快速分析，在中藥成分體系定性定量分析方面已成為重要的研究手段[5-9]。本試驗采用UPLC-QTOF/MS技術(shù)對桑葉甲醇提取物進(jìn)行全成分掃描與快速鑒定，根據(jù)其準(zhǔn)分子離子峰以及二級碎片離子、文獻(xiàn)數(shù)據(jù)等，鑒定桑葉中的化學(xué)成分，為全面有效地建立桑葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及現(xiàn)代開發(fā)提供支撐。

1 儀器與試藥

超高效液相色譜串聯(lián)四級桿/飛行時間質(zhì)譜（UHPLC-H-CLASS/XEVO G2-XS Qtof）聯(lián)用儀（美國Waters公司），配有Masslynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；ACQUITY UPLC BEHC18色譜柱（美國Waters公司）；RE52系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海雅榮生物設(shè)備儀器有限公司）；CP114型電子精密天平（奧豪斯儀器有限公司）；DTD系列超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；H1850R離心機(jī)（湖南湘儀公司）；PINE-TREE型超純水制水機(jī)（北京湘順源科技有限公司）；移液器（上海大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司）。endprint

綠原酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110753-201415），蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100080-201409），異槲皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111809-201403）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Tedia公司），甲酸（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。桑葉，產(chǎn)于湖南長沙，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)石繼連副教授鑒定為?？浦参锷orus alba L.的干燥葉，低溫干燥粉碎后過40目篩備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取綠原酸8.0 mg、蘆丁5.0 mg、異槲皮苷5.5 mg、紫云英苷5.0 mg，分別置于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻，進(jìn)樣前稀釋至1～100 ng/mL并過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.2 供試品溶液的制備

稱取適量桑葉樣品，低溫干燥粉碎后過40目篩，精密稱定樣品粉末1 g，置具塞錐形瓶中，加50%甲醇90 mL，密塞，精密稱定，超聲提取（功率100 W，頻率40 kHz）1 h，取出后放冷至室溫，再次精密稱定，加50%甲醇補足減失的質(zhì)量，12 000 r/min高速離心15 min，取上清液，用0.22 ?m微孔濾膜過濾后作為供試品溶液。

2.3 液質(zhì)聯(lián)用條件

2.3.1 色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相A為0.1%甲酸水溶液、B為乙腈，梯度洗脫（0～5 min，10%～16%B；5～9 min，16%～24%B；9～14 min，24%～76%B；14～20 min，76%～100%B；20～25 min，100%～10%B）；進(jìn)樣量1 μL；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），用負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，使用高純氮氣作為霧化器和輔助氣，氬氣作為碰撞氣，離子源溫度為120 ℃，去溶劑化溫度300 ℃，錐孔氣流50 L/h，去溶劑化氣流800 L/h，噴霧電壓-4500 V，溫度600 ℃，碰撞電壓30 V，校正離子554.262 0 m/z，質(zhì)量數(shù)掃描范圍m/z 100～1200，數(shù)據(jù)采集時間25 min。

2.4 桑葉中化學(xué)成分確認(rèn)

按“2.3”項下條件對50%甲醇提取桑葉藥材成分進(jìn)行定性分析，桑葉樣品在ESI-模式下獲得了良好的響應(yīng)值，其（-）ESI-MS的質(zhì)譜總離子流圖（TIC）見圖1。采用Masslynx4.1軟件分析其中各化學(xué)成分的保留時間及其質(zhì)譜信息，并結(jié)合其分子離子峰與對照品、文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，再對其中的化學(xué)成分進(jìn)行辨別，從而鑒定出桑葉提取物中19個化合物，鑒定結(jié)果見表1。

桑葉主要含黃酮類和咖啡?？崴犷惢衔铮@2種物質(zhì)在負(fù)離子模式下，其羥基更容易形成穩(wěn)定的氧負(fù)離子，產(chǎn)生[M-H]-準(zhǔn)分子離子峰信號。由于兩類化合物分別具有相同的母核，在質(zhì)譜中有相似的規(guī)律，故本文選擇具有代表性的8號咖啡?？崴犷惡?、9、12、13、19號黃酮類化合物，詳細(xì)分析其裂解過程。

2.4.1 咖啡酰奎尼酸類裂解規(guī)律

8號化合物：3-咖啡?？崴幔ňG原酸）為例，在質(zhì)譜負(fù)離子模式條件下，保留時間2.62 min，一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 353.070 4，酰氧鍵斷裂形成m/z 179.031 9的[M-qunic-H]-碎片離子及m/z 191.053 7的[M-caffeoyl-H]-碎片離子，兩碎片離子分別進(jìn)一步脫去一分子CO2和H2O，形成m/z 135.042 5及m/z 173.043 0的碎片離子，并結(jié)合對照品信息可推斷該化合物。二級質(zhì)譜裂解圖見圖2，裂解途徑見圖3。

2.4.2 黃酮苷類裂解規(guī)律

化合物6：在保留時間2.51 min，一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 625.141 4 [M-H]-，在負(fù)離子模式下該化合物分別出現(xiàn)了二級碎片離子m/z 463.087 0和m/z 301.031 8，由此推斷該化合物有槲皮素母核為黃酮苷類成分。結(jié)合文獻(xiàn)報道，準(zhǔn)分子離子峰失去一分子半乳糖m/z 162.055 0和一分子葡萄糖m/z 162.054 2形成的，推測該化合物為槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖-（1→2）- β-D-葡萄糖。

化合物9：在保留時間3.48 min，一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 609.146 4 [M-H]-，在負(fù)離子模式下該化合物分別出現(xiàn)了二級碎片離子m/z 447.091 3和m/z 285.037 5，同時C環(huán)發(fā)生RDA裂解，產(chǎn)生m/z 151.894 2的碎片離子，推測為準(zhǔn)分子離子峰失去一分子鼠李糖m/z 162.055 1和一分子葡萄糖m/z 162.053 8形成的。綜合質(zhì)譜信息及文獻(xiàn)報道，推測該化合物為木犀草素-3-O-β-D-槐糖苷。

化合物12：在保留時間6.37 min下，一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 609.146 5 [M-H]-，負(fù)離子模式下，m/z 609.146 5脫掉C環(huán)3位羥基上的一分子蕓香糖m/z 308.111 3生成碎片離子m/z 301.035 2；脫去鼠李糖m/z 146.067 9生成m/z 463.078 6碎片離子，該離子繼續(xù)脫去葡萄糖得到苷元碎片m/z 301.032 4和m/z 300.025 2。其中m/z 301.032 4的豐度明顯小于m/z 300.025 2，說明C環(huán)3位糖苷鍵主要以均裂方式斷裂。再對比對照品蘆丁的保留時間及質(zhì)譜信息，推斷12號峰為蘆丁。

化合物13：保留時間6.95 min，根據(jù)母離子m/z 463.087 1 [M-H]-，可得到化合物分子式為C21H20O12。該化合物的二級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了m/z 301.031 8的碎片離子，為脫去一分子中性葡萄糖的槲皮素苷元碎片的離子峰[（M-H）-162]-；m/z 271.021 3為槲皮素失去一分子CO后分子結(jié)構(gòu)重排脫去2個H的碎片離子，由此推斷該化合物可能有槲皮素母核。結(jié)合對照品信息，可推測該化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖苷（異槲皮苷），其二級質(zhì)譜裂解圖見圖4，裂解途徑見圖5。endprint

化合物16：保留時間8.26 min，根據(jù)母離子[M-H]- m/z 447.091 9，可推測化合物分子式為C21H20O11。該化合物的二級質(zhì)譜圖中出現(xiàn)了m/z 285.036 0的碎片離子，為脫去一分子葡萄糖的山奈酚苷元碎片的離子峰；m/z 255.026 9為苷元碎片失去一分子CO后分子結(jié)構(gòu)重排脫去2個H生成，該碎片離子繼續(xù)失去一分子CO生成m/z 227.031 8碎片離子，結(jié)合對照品信息，可推測該化合物為山柰酚-3-葡萄糖苷（紫云英苷）。

化合物19：保留時間15.22 min，其負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 577.267 5，計算其分子式可能為C27H30O14，其二級質(zhì)譜產(chǎn)生了m/z 269.087 0的碎片離子，可推斷為失去一分子蕓香糖m/z 308.180 5的芹菜素苷元，結(jié)合文獻(xiàn)信息可推斷該化合物為芹菜素-7-O-蕓香糖苷。

綜上可知，黃酮苷類化合物主要由黃酮苷元及糖苷構(gòu)成，主要裂解方式是產(chǎn)生脫去糖基的碎片離子，含有的糖基主要是鼠李糖、半乳糖、葡萄糖和蕓香糖，以ESI負(fù)離子模式為例，其主要產(chǎn)生丟失該糖基的[M-H-146]-、[M-H-162]-、[M-H-162]-、[M-H-308]-。苷元結(jié)構(gòu)黃酮母核C環(huán)脫去一分子CO（28 Da），或C環(huán)發(fā)生RDA再裂解，產(chǎn)生[M-101]-和[M-120]-碎片離子。根據(jù)該裂解方式及其各峰的質(zhì)譜裂解信息，故可推斷黃酮類化合物結(jié)構(gòu)。

2.4.3 其他類裂解規(guī)律

化合物10：在保留時間4.32 min下，一級質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰為m/z 579.300 9，負(fù)離子模式下，發(fā)生Mclafferty重排失去中性間苯二酚，得到m/z 469.778 4和m/z358.810 9。結(jié)合文獻(xiàn)的相關(guān)信息，推斷12號峰為Diels-Alder型加和物桑呋喃J，其二級質(zhì)譜裂解圖見圖6，裂解途徑見圖7。

3 討論

本研究采用UPLC-Q-TOF/MS結(jié)合Masslynx4.1軟件數(shù)據(jù)處理方法，根據(jù)色譜峰的準(zhǔn)分子離子峰，結(jié)合其二級質(zhì)譜信息快速成功鑒別了桑葉甲醇提取物的19個化合物，包括3個咖啡?？崴犷惢衔?、12個黃酮類化合物、4個有機(jī)酚酸（酯）類化合物，且有4個化合物得到了對照品驗證。UPLC-Q-TOF/MS具有操作簡單、準(zhǔn)確、快速、無需對照品等特點，對于中藥復(fù)雜體系中活效成分的初步定性研究及產(chǎn)物的分離具有重要意義。本試驗可為桑葉的質(zhì)量控制、原料產(chǎn)品開發(fā)提供保障，并為進(jìn)一步桑葉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供了化學(xué)依據(jù)。

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