蘇云金芽孢桿菌殺蟲活性的增效機制研究進展

李超峰

鹽城師范學(xué)院, 江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點實驗室, 江蘇 鹽城 224007

蘇云金芽孢桿菌(Bacilliusthuringiensis,Bt)為革蘭氏陽性昆蟲病原細菌，可以產(chǎn)生具有殺蟲活性的伴孢晶體蛋白，又稱殺蟲晶體蛋白(insecticide crystal proteins，ICPs)或δ-內(nèi)毒素[1]。此外，α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、熱不穩(wěn)定性外毒素和營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative insecticidal protein，VIP)以及芽孢都有一定的殺蟲活性[1]。然而，Bt毒素具有多樣性，如根據(jù)Bt毒素晶體狀態(tài)的不同可將其分為Cry毒素和Cyt毒素，而Bt又可分為不同的亞種，其毒素的種類和性質(zhì)也不相同，從而使得其殺蟲活性有較大差異[1]。鑒于人們對環(huán)境保護、食品安全和病蟲害對化學(xué)農(nóng)藥抗藥性認識的逐步深入，生物農(nóng)藥的研究和應(yīng)用有了突飛猛進的發(fā)展。蘇云金芽孢桿菌制劑以其高效、特異性強以及對環(huán)境、人畜安全等優(yōu)勢已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)應(yīng)用最廣、用量最大、效果最好的生物殺蟲劑，因此，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和貯藏等領(lǐng)域的害蟲防治。

但在實際生產(chǎn)中，Bt制劑存在速效性差、持效期短、防效不穩(wěn)定、殺蟲譜較窄等諸多缺陷。為了克服這些缺陷，人們提出了一系列提高Bt毒性、增強防效穩(wěn)定性的策略。如分離篩選殺蟲活性高、特異性強的高效菌株；遺傳改良現(xiàn)有高毒菌株；改進制劑制備技術(shù)；深度發(fā)掘各種高效生物、化學(xué)增效物質(zhì)與增效因子等[2,3]。然而，大規(guī)模篩選高效菌株效率極其低下，且極為困難；而遺傳改良菌株的穩(wěn)定性差，在實踐應(yīng)用中難以實現(xiàn)。因此，快速、穩(wěn)定、有效的增效物質(zhì)、制劑和因子等的開發(fā)和應(yīng)用受到越來越多的關(guān)注。只有清晰地了解增效物質(zhì)、制劑和因子的作用方式和途徑，才能更好地指導(dǎo)增效物質(zhì)、制劑和因子在實踐中的應(yīng)用。本文在介紹Bt殺蟲毒素蛋白作用機制的基礎(chǔ)上，概述了不同增效方式與途徑的研究進展，以期為蘇云金芽孢桿菌生物制劑作用機制的研究提供一定的方向，同時，為增效劑在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 蘇云金桿菌殺蟲活性的作用機制

在田間，受長時間的高溫、光照以及紫外輻射和電離輻射等的影響，大量羥自由基等活性氧的產(chǎn)生使細胞內(nèi)生物大分子如DNA和蛋白質(zhì)(包括Bt毒素蛋白)等的生物活性降低或者喪失。為了開發(fā)安全、高效的Bt生物制劑，明確其作用機制和增效機制尤為重要，因此，國內(nèi)外對其展開了廣泛而深入的研究。目前，被廣泛接受的Bt作用模型有孔洞/順序結(jié)合模式和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式[1,4～11]。

孔洞/順序結(jié)合模式認為殺蟲晶體蛋白被攝食后，昆蟲腸道堿性環(huán)境將其溶解，進而被水解激活，55～65 kDa活化的Cry毒素與中腸上皮細胞刷狀緣膜囊泡(brush border membrane vesicles，BBMVs)脂筏上的受體蛋白氨肽酶N(aminopeptidase N，APN)及堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，ALP)結(jié)合、聚集，而后，再次與鈣粘蛋白(cadherin)受體結(jié)合，使其構(gòu)象改變，發(fā)生寡聚化，再與氨肽酶N 及堿性磷酸酯酶結(jié)合，進而插入上皮細胞，使細胞膜產(chǎn)生孔洞，裂解，最終導(dǎo)致昆蟲死亡(圖1)[1,4～6]。該模式需要多個受體的逐步參與，且能較好地解釋殺蟲蛋白與各受體結(jié)合能力的改變，或者受體表達水平的改變都能夠?qū)е吕ハx對殺蟲蛋白不敏感或敏感性降低的現(xiàn)象，即受體結(jié)合能力、表達水平或結(jié)構(gòu)修飾均可以改變殺蟲活性的敏感性。然而，在該模式中，如只表達多受體中的一種，也能夠?qū)е录毎麑σ环N或多種毒素的敏感性降低[1]。

圖1 Cry毒素作用的孔洞模式Fig.1 Cry toxin action model of pore formation.

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式完全不同于破壞細胞滲透壓的孔洞模式，其認為活化的殺蟲蛋白特異地結(jié)合了中腸上皮細胞上的受體鈣粘蛋白，使得G蛋白(guanine nucleotide-binding regulatory protein)和腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase,AC)被激活，磷酸腺苷環(huán)化可產(chǎn)生大量的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，進而激活蛋白激酶A(proteinkinase A,PKA)，引發(fā)細胞骨架重排、離子流動等一系列變化以及第二信號途徑的加快，最終導(dǎo)致細胞死亡。同時，活化的殺蟲蛋白與受體的結(jié)合，增加了鈣粘蛋白從細胞內(nèi)膜小囊泡到細胞膜的定向運輸(圖2)[7～10]。該模式依賴于Mg2+催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)向cAMP轉(zhuǎn)化，Cry1Ab殺蟲蛋白可導(dǎo)致細胞形態(tài)改變，如膨脹、破裂，而二價陽離子螯合劑可以阻止Cry1Ab對表達鈣粘蛋白的昆蟲細胞的破壞，同時，細胞中也存在對殺蟲蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的防御機制，可對損傷的部分上皮層表皮細胞進行修復(fù)[7,9,11]。因此，該模式忽略了其他系列受體的作用，也難以解釋與受體結(jié)合能力未發(fā)生改變的殺蟲蛋白突變體沒有殺蟲活性的現(xiàn)象。

圖2 Cry毒素作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式Fig.2 Cry toxin action model of signal transduction.

2 蘇云金桿菌殺蟲活性的增效方式

2.1 增加Bt制劑的攝入量，提高其有效利用率

無論何種寄主植物，絕大多數(shù)昆蟲對Bt都具有一定的拒食作用，且根據(jù)次生代謝產(chǎn)物組成的不同，昆蟲對寄主植物的取食嗜好也有所差異，對附著于植物器官表面的殺蟲蛋白等毒素的攝食量也不同，昆蟲攝食的殺蟲蛋白等毒素不充分，進而導(dǎo)致殺蟲效率降低[12,13]。棉籽粉、蔗糖、葡萄糖、粗棉籽油和吐溫80等取食刺激劑和表面活性劑可通過增加目標昆蟲的適口性，或降低生物制劑水溶液表面張力來改善藥液在植物葉面的附著效果等，以提高Bt制劑的有效利用率，減少使用量，從而達到增效作用[14]。

2.2 改變目標昆蟲中腸pH環(huán)境，提高原毒素溶解和活化的機率

攝入的原毒素只有經(jīng)過溶解和活化才能啟動殺蟲活性，目標昆蟲中腸的堿性、還原性環(huán)境，與蛋白酶的共同作用將實現(xiàn)其溶解和活化。因此，中腸環(huán)境和內(nèi)容物對原毒素的溶解和活化是非常關(guān)鍵的，也是實現(xiàn)殺蟲活性增效作用的第一個環(huán)節(jié)。化學(xué)添加劑中堿性化合物、蛋白質(zhì)助溶劑和二價金屬離子等分別可使敏感昆蟲中腸的堿性提高(pH增大)、還原性增加，以及蛋白酶被激活和活性提高，從而使原毒素的溶解和活化得以促進，達到活性增效的目的[2,15]。其次，除了可使殺蟲蛋白的溶解加速，無機鹽、絲氨酸、精氨酸、丙氨酸、色氨酸、已酰胺、硝酸鈉等多種含氮化合物還可以改變昆蟲血液、淋巴液的酸堿環(huán)境和化學(xué)組成，影響正常的生理代謝過程，提高其對病原的敏感性，從而改善殺蟲蛋白的毒效，進而達到增效目的[2,15～18]。此外，硼砂、硼酸、單寧酸和間苯二酚等具有適度毒性的化合物也可對Bt產(chǎn)生增效作用，但這些化合物對Bt生長具有一定的抑制作用，因此，作為復(fù)配劑時需要注意其組成比例[17,18]。

2.3 改變毒素蛋白的結(jié)合活性，增加毒素蛋白的利用率

原毒素被激活后，要經(jīng)過與受體結(jié)合、插入上皮細胞，并形成孔洞或離子通道等一系列過程才能實現(xiàn)殺蟲活性，因此，該環(huán)節(jié)任何一步的改變都將影響殺蟲效率。首先，增效劑通過降低中腸蛋白酶水解活性，增加毒素蛋白與受體識別機率，促進具有良好插入能力的雜合寡聚體的形成與聚集，加速昆蟲上皮細胞受體孔道的形成，離子滲透能力加強，從而實現(xiàn)對殺蟲蛋白的增效作用[6,19～29]。其次，Cyt1Aa殺蟲蛋白具有高度親脂性，在體內(nèi)結(jié)合到中腸微孔膜后，為Cry蛋白提供了額外的受體結(jié)合位點，提高了Cry毒素的結(jié)合機率，觸發(fā)了插入膜囊前的成孔寡聚前體結(jié)構(gòu)的形成，進而促進成孔、離子通道的形成和毒素作用的發(fā)揮[6,19,21,30]。蘇云金芽孢桿菌可以產(chǎn)生不同的殺蟲蛋白，不同殺蟲蛋白的毒力和功能都不同，而不同功能的殺蟲蛋白所產(chǎn)生的聯(lián)合作用較單一毒素更為有效[5]。Tabashnik[31]提出了測定聯(lián)合作用的方法并證明了Bt以色列亞種27 kDa CytA毒素和130 kDa或65 kDa的Cry4對消滅埃及伊蚊具有增效作用，而在2種Cry4毒素間或Cry1A不同毒素間無協(xié)同增效作用。Bt 4Q7菌株表達的135 kDa Cry1Aa和130 kDa Cry1A 2種毒素混合物對消滅甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)和棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)都具有增效作用[26]。與大腸桿菌(Escherichiacoli)共表達的130 kDa Bt以色列亞種Cry4Ba和29 kDa Bt達姆斯塔特亞種 Cyt2Aa2對消滅埃及伊蚊和致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)具有協(xié)同增效作用[22]。

δ-內(nèi)毒素的不同毒素蛋白間的協(xié)同作用機理較為復(fù)雜。如Bt以色列亞種可產(chǎn)生不同的Cry和Cyt毒素，每種毒素對蚊幼蟲都具有殺蟲活性，而共同作用時則具有協(xié)同增效作用。這種協(xié)同增效作用是由于Cyt1Aa為Cry11Aa提供了額外的結(jié)合位點，使得插入細胞膜通道前體高效形成，進而促進離子通道的形成和與目標膜的結(jié)合，從而實現(xiàn)對Cry11Aa的增效作用，并降低害蟲對Cry11Aa殺蟲蛋白的抗性[6,21]。同樣，Cyt1A98毒素通過為Cry4BLB毒素在埃及伊蚊(Aedesaegypti)BBMVs提供額外的結(jié)合位點，促使Cry4BLB殺蟲蛋白寡聚結(jié)構(gòu)的形成，從而實現(xiàn)其協(xié)同增效作用[23]。而Cry4Ba毒素則通過發(fā)夾結(jié)構(gòu)β2-β3區(qū)域Thr328殘基和β4-β5區(qū)域Thr328殘基增強與Cyt2Aa額外受體的結(jié)合，實現(xiàn)其協(xié)同增效作用[20]。除了不同殺蟲蛋白間的協(xié)同增效作用，中腸受體蛋白多肽如鈣粘蛋白多肽和蛋白氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)多肽等對不同的Cry毒素也具有協(xié)同增效作用[10]。原核表達的鈣粘蛋白CR12-MPED片段通過增加Cry1A在昆蟲中腸BBMV上的結(jié)合位點，吸引Cry1A與中腸上皮細胞膜結(jié)合，進而顯著增強了Cry1A 對煙草天蛾(Manducasexta)、煙芽夜蛾(Helicoverpavirescens)和美洲棉鈴蟲(HelicoverpazeaBoddie)幼蟲的毒性[32]。研究表明，煙草天蛾中腸鈣粘蛋白的CR7和CR11區(qū)域片段同樣可增強Cry1Ac和Cry1Ab對煙草天蛾幼蟲的毒性，并進一步證實鈣粘蛋白片段能促使毒素的寡聚化，從而對毒素起到增效作用[24]。玉米根葉甲鈣粘蛋白的CR 8～10區(qū)域片段與Cry3Aa、Cry3Bb和Cry8Ca毒素結(jié)合，有利于Cry毒素寡聚化，進而插入膜內(nèi)以實現(xiàn)其增效作用[33]。草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)和煙草天蛾的鈣粘蛋白(SfCad與MsCad)通過保護Cry1Fa免受昆蟲中腸蛋白酶的降解，提高了Cry1Fa在其中腸上的聚集，增加了Cry1Fa的殺蟲活性[25]。原核表達的岡比亞按蚊 (Anophelesgambiae)28 kDa AgAPN2ta片段和30 kDa AgAPN2tb片段與Bt Cry11Ba毒素的結(jié)合顯示出不同的協(xié)同作用，即AgAPN2tb片段顯著增強了Cry11Ba毒素的毒性，而AgAPN2ta片段卻較大程度的抑制了Cry11Ba毒素的毒性[10]。此外，一些重組表達的Bt毒素蛋白和鈣粘蛋白之間也可實現(xiàn)協(xié)同增效作用，如Cry11Ba與Cry4Aa、Cry46Ab與Cry4Aa對尖音庫蚊(Culexpipiens)幼蟲[34,35]，重組鈣粘蛋白(SlABCC3和Hacadherin)與活化的Cry1Ac對斜紋夜蛾(Spodopteralitura)幼蟲[36]，Cyt1Aa與Cry4Aa對蚋屬蠅(Simuliumspp.)幼蟲的毒性等[37]。

2.4 降低目標昆蟲中腸完整性，加快毒素蛋白作用的發(fā)揮

圍食膜(peritrophic membrane，PM)主要由幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)組成，可保護中腸上皮細胞，阻止病原物等侵染，是中腸細胞和腸腔之間的防御性屏障[38]。完整圍食膜中幾丁質(zhì)、酸性粘多糖、粘蛋白(intestinal mucin，IM)，以及其他多種蛋白質(zhì)的降解消化，將使圍食膜的致密性、堅韌性降低，滲透性增強，從而使Bt和病原微生物的通過率提高，進而實現(xiàn)對Bt的增效作用[39]。病原性病毒的增效蛋白或蛋白因子等通過對圍食膜組成的降解，使其結(jié)構(gòu)改變,通透性增加。如經(jīng)口感染昆蟲的核型多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus, NPV)后，Bt更加順利地通過圍食膜到達中腸細胞，進而使其對昆蟲的感染力和自身利用效率得以提高，從而實現(xiàn)對Bt毒力的增效活性[40]。其次，使完整性圍食膜難以生成也是實現(xiàn)對Bt增效的途徑之一。通過與中腸新合成的幾丁質(zhì)結(jié)合，或者阻止圍食膜蛋白與幾丁質(zhì)的正常結(jié)合、昆蟲中腸幾丁質(zhì)微纖絲的形成，進而導(dǎo)致完整圍食膜難以形成，從而實現(xiàn)毒素蛋白和病原微生物的高效通過率[39,41]。

2.5 改善環(huán)境因素，降低毒素蛋白殺蟲活性的損失

自然輻射直接或通過水介質(zhì)中產(chǎn)生的自由基和活性氧群的間接作用對機體內(nèi)DNA或蛋白質(zhì)等細胞內(nèi)生物大分子造成損傷，使其生物活性降低或喪失。同樣，ICPs、α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、VIPs和芽孢等也受高溫、強光、紫外輻射和電離輻射等環(huán)境因素的影響，進而影響其殺蟲活性。即在施用的自然環(huán)境中受多種環(huán)境因素的影響(包括溫度、光照、紫外輻射和電離輻射等)，原毒素的組氨酸和酪氨酸等組成氨基酸受到損傷，多級結(jié)構(gòu)均被破壞，進而變性，難以溶解和激活成具有殺蟲活性的毒素蛋白，從而與靶昆蟲中腸受體的結(jié)合受到影響，進而降低殺蟲活性[2,25,41,42]。黑色素、二苯乙烯類熒光增白劑等光穩(wěn)定劑或其他作為Bt制劑增效劑的增效機制是，通過反射可見光，吸收高能量紫外輻射；或者通過提供質(zhì)子，捕獲自由基，形成穩(wěn)定的共振結(jié)構(gòu)，阻斷氧化；或者通過與氧作用消耗密閉系統(tǒng)中殘留的氧；或者通過螯合金屬離子，減少金屬離子對氧化的催化作用；或者通過淬滅單線態(tài)氧，阻止光氧化[41,43]。

2.6 其他

Bt蛋白的殺蟲活性得以實現(xiàn)，需經(jīng)過攝食、溶解、酶解激活、結(jié)合受體、插入上皮細胞，以及形成孔洞或離子通道等作用過程，修飾、改變其中任何環(huán)節(jié)都會對Bt蛋白的殺蟲活性產(chǎn)生影響。然而，除上述作用途徑或方式外，增效劑通過延緩昆蟲對毒素蛋白產(chǎn)生抗性或改變昆蟲體內(nèi)生化途徑等也可實現(xiàn)對Bt制劑的增效作用。如納米銀顆粒通過延緩埃及伊蚊對Bt以色列菌株產(chǎn)生抗性，以達到協(xié)同增效作用[43]。馬來酸與檸檬酸等通過參與三羧酸循環(huán)，增強了昆蟲體內(nèi)相關(guān)酶的活性，進而使得昆蟲對殺蟲毒素變得更為敏感，從而實現(xiàn)其增效作用[44]。而植物提取物則通過改變Bt制劑的物理性狀、干擾昆蟲的生理生化指標，或者通過目標昆蟲自身存在的感覺和/或免疫系統(tǒng)，對自身行為進行調(diào)節(jié)，從而實現(xiàn)其增效作用[45～49]。

3 展望

作為研究較為深入的生物殺蟲劑，Bt毒素蛋白的種類、氨基酸殘基序列、殺蟲譜和三維結(jié)構(gòu)等均具有多樣性，其不同于常規(guī)的化學(xué)殺蟲劑，與昆蟲靶標之間的相互作用已進化到極其復(fù)雜的水平。毒素蛋白殺蟲活性的發(fā)揮需要多種因素的共同作用，同時，昆蟲對毒素蛋白的反應(yīng)也具有多樣性，因此，Bt殺蟲機制與增效作用機理的不確定性需要進一步的揭示，且需要多方位的進行。分子生物學(xué)是目前研究中比較集中采用的手段或途徑，且主要集中于研究不同毒素蛋白之間的協(xié)同作用。然而，Bt殺蟲活性的實現(xiàn)是一系列的系統(tǒng)過程(包括孔洞模式和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模式)，也需要考慮目標害蟲的生理生化變化、組織等的病理學(xué)改變與攝食毒素蛋白(增效劑)后的改變等內(nèi)在因素。其次，除內(nèi)在因素外，昆蟲的化學(xué)感覺器作用、寄主植物與增效劑間的化感作用等外在變化也需要進一步的深入研究。最后，研究還發(fā)現(xiàn)寡聚化和插入是Cyt1Aa實現(xiàn)殺蟲活性的必要條件，但不是充分條件[11]，因此，Bt毒素蛋白的殺蟲活性機制是否存在限速步驟，若存在，又能否通過限制性步驟進一步實現(xiàn)增效劑的增效活性，這為深度了解晶體毒素的殺蟲和增效機制提出了新的研究思路。

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