利用BmNPV-家蠶表達(dá)系統(tǒng)包裝重組腺相關(guān)病毒2型(rAAV2)研究

魯 念, 劉興健, 胡小元, 李軼女, 易詠竹, 張志芳*

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所, 江蘇 鎮(zhèn)江 212018

腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)是無包膜的單鏈DNA(single-strand DNA，ssDNA)病毒，直徑為18～25 nm。到目前為止，研究人員發(fā)現(xiàn)其至少有120種新血清型，其中，已經(jīng)從人類和靈長類中分離鑒定到的血清型有12種[1]。

AAV主要由反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat sequences，ITRs)、復(fù)制基因(rep)和衣殼基因(cap)3個(gè)結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成。ITRs折疊形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，是AAV復(fù)制、包裝、整合所需的唯一的順式作用元件，在病毒粒子轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)可能起到穩(wěn)定病毒基因組的作用；rep編碼的蛋白質(zhì)可將AAV基因組從宿主染色體上切割下來，并調(diào)節(jié)基因組的復(fù)制、整合和包裝；而cap編碼的3個(gè)衣殼蛋白(VP1、VP2和VP3)[2]可自組裝成無包膜的二十面體病毒衣殼。

AAV最早于19世紀(jì)60年代從腺病毒中被分離出來，并通過血清學(xué)等分析方法將其歸納到細(xì)小病毒科(Prvovirdae)依賴病毒屬(Dependovirus)。1984年，作為病毒載體， AAV首次被用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源基因[3]。因?yàn)锳AV具有安全性高(至今未發(fā)現(xiàn)其對(duì)人具有致病作用)、特異性強(qiáng)(有數(shù)十種血清型，不同血清型對(duì)不同器官具有特異識(shí)別感染能力)、擴(kuò)散性強(qiáng)(具有遠(yuǎn)高于腺病毒和慢病毒的擴(kuò)散性)、免疫原性低(感染不同組織時(shí)幾乎不會(huì)被免疫系統(tǒng)清除)、感染譜廣(可感染分裂期和靜止期的細(xì)胞)等優(yōu)點(diǎn)[4]，使其逐漸成為基因治療中最常用的病毒載體。

AAV包裝一般是在人源或哺乳動(dòng)物來源的細(xì)胞以及昆蟲細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)的[5]。如在人胚胎腎細(xì)胞(HEK293T)中，先將含有rep、cap基因的質(zhì)粒pHelper和含有目的基因的質(zhì)粒pAAV轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，再通過輔助病毒誘導(dǎo)得到目的rAAV。該方法獲得rAAV的生產(chǎn)效率最高只能達(dá)到104vg/cell[6]。為了得到足夠用于臨床試驗(yàn)的rAAV，至少需要培養(yǎng)5 000瓶175 cm2細(xì)胞瓶的細(xì)胞[7]，且操作較為復(fù)雜，在實(shí)際應(yīng)用中難以實(shí)現(xiàn)。另一種方法則是利用桿狀病毒-細(xì)胞(如AcMNPV-sf細(xì)胞)表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中包裝rAAV[8]，將包裝rAAV所需的基因分別克隆到桿狀病毒上，并用這些桿狀病毒共同感染草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)卵巢細(xì)胞系Sf9，從而在懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中獲得rAAV，用10 L攪拌罐反應(yīng)器發(fā)酵約3 d，其產(chǎn)量達(dá)到1.1×1014vg/L[9]，該方法較用人源細(xì)胞包裝的方法便利，但在實(shí)際應(yīng)用中，該方法包裝的rAAV單次治愈劑量的標(biāo)價(jià)高達(dá)160萬美元，由于造價(jià)較高，無法實(shí)現(xiàn)廣泛應(yīng)用。

BmNPV表達(dá)系統(tǒng)也是一種較為常用的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在重組蛋白表達(dá)應(yīng)用中，5個(gè)蠶蛹外源蛋白的表達(dá)量就相當(dāng)于1 L昆蟲細(xì)胞的表達(dá)量[10]，而其生產(chǎn)成本比昆蟲細(xì)胞低幾百倍。因此，BmNPV表達(dá)系統(tǒng)可以作為生產(chǎn)rAAV的一種經(jīng)濟(jì)高效的選擇。在家蠶幼蟲的血淋巴中各類基因的表達(dá)量分別是在sf細(xì)胞中表達(dá)量的幾十倍甚至上百倍。而BmNPV-家蠶表達(dá)系統(tǒng)與AcMNPV-sf細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比表達(dá)量較高的主要原因是：AcMNPV在sf細(xì)胞培養(yǎng)基中的病毒基因組數(shù)目通常為108～109vg/mL，即使在高密度發(fā)酵的昆蟲細(xì)胞中也很難超過1010vg/mL，其rAAV的理論包裝量也不應(yīng)該超過這一數(shù)值；而BmNPV在每毫升家蠶血淋巴和每克蠶蛹中的病毒基因組數(shù)目均能達(dá)到1012～1013vg[11]，因此用BmNPV-家蠶表達(dá)系統(tǒng)包裝rAAV的最高理論包裝量至少是等體積AcMNPV-sf細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的上百倍。此外，家蠶的飼養(yǎng)成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)成本。綜上所述，BmNPV-家蠶表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)比較理想的生產(chǎn)rAAV的系統(tǒng)。

本研究利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)來包裝含有報(bào)告基因的2型 AAV(AAV2)。AAV2是最早用作病毒載體的血清型[3]，也是目前為止最適合用做基因治療載體的血清型[12]，大多數(shù)基因治療研究也都是以2型為模型。為了簡便研究，本次實(shí)驗(yàn)使用的是假型包裝載體(pseudotype virus)[13]，即這種載體的所有重組基因組都用AAV2型的ITRs和rep基因，只有cap是根據(jù)需要選擇血清型。因此，不同血清型的物理性質(zhì)已經(jīng)足夠親近，使得它們能夠用接近2型的條件來生產(chǎn)純化。

目前并沒有使用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)包裝rAAV的研究，本次實(shí)驗(yàn)首次使用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)包裝rAAV，為今后使用單桿狀病毒包裝rAAV提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司，F(xiàn)ast pfu購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，TC100培養(yǎng)基購自Applichem公司，DMEM(高糖)培養(yǎng)基、FBS購自Gibco公司，脂質(zhì)體購自Invitrogen公司。

1.1.2供試載體、質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒 桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pVL1393購自Invitrogen公司，病毒復(fù)制基因失活拯救型家蠶桿狀病毒reBmBac、表達(dá)綠色熒光蛋白的重組水泡性口炎病毒(VSV-GFP)均由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌DH10Bac、Top10、家蠶細(xì)胞BmN細(xì)胞系、人胚胎腎細(xì)胞HEK293T細(xì)胞系等為本實(shí)驗(yàn)室保存。

BmN細(xì)胞系的培養(yǎng)和準(zhǔn)備：根據(jù)Summers和Smith的操作手冊[14]，用含有FBS的TC100昆蟲培養(yǎng)基培養(yǎng)家蠶BmN細(xì)胞系，達(dá)到合適的密度(106個(gè)/mL)后,接種到六孔板中或者35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)8～12 h，用于共轉(zhuǎn)染構(gòu)建重組病毒。

HEK293T細(xì)胞系的培養(yǎng)和準(zhǔn)備：用DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞系，達(dá)到合適的密度(106個(gè)/mL)后,接種到六孔板中或35 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)8～12 h，用于檢測包裝后的rAAV2病毒活力。

1.1.3AAV2的獲得 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，獲得了AAV2病毒的rep2序列(GenBank: AF043303 )、cap2序列(GenBank：AAA42372)。Chen[16]研究發(fā)現(xiàn)，將cap2啟動(dòng)子改為polh，研究表明在cap序列中插入一個(gè)intron(將家蠶polh啟動(dòng)子序列插入intron序列的第26位堿基)能有效提高蛋白的表達(dá)，本研究在rep2序列的第850位堿基、cap2 VP1的第25位堿基后分別插入intron(含家蠶polh)。同時(shí)，在啟動(dòng)子序列前插入BglⅡ酶切位點(diǎn)，在cap2序列后插入XbaⅠ，以方便后續(xù)進(jìn)行血清型的替換。在設(shè)計(jì)完成的rep2序列5′端加上BglⅡ酶切位點(diǎn)和Kozak序列，3′端加上終止密碼子、單純皰疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV tk)polyA和XbaⅠ酶切位點(diǎn)；在設(shè)計(jì)完成的cap2序列5′端加上BamHⅠ酶切位點(diǎn)和Kozak序列，3′端加上終止密碼子、牛生長素(bovine growth hormone，BGH)polyA和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)完成后交由南京金斯瑞公司進(jìn)行合成并克隆到pUC-simple載體上，得到pUC-Cap2和pUC-Rep2。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15]，獲得了AAV2兩端ITRs序列，在ITRs序列中間插入CMV啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)(multiple cloning site，MCS)。尾端插入猴病毒40(simian virus 40，SV40)polyA，在設(shè)計(jì)完成的ITRs序列5′端加上EcoR V酶切位點(diǎn)，3′端加上BglⅡ酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)完成后交由南京金斯瑞公司進(jìn)行合成并克隆到pUC-simple載體上，得到pUC-ITRs-MCS。

1.2 含AAV2基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

將載體pUC-ITRs-MCS用EcoR V-BglⅡ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段ITRs-MCS，與經(jīng)同樣雙酶切處理的轉(zhuǎn)移載體pVL1393用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，在含有Amp抗生素的LB平板上培養(yǎng)。獲得陽性克隆后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，篩選出連接有相應(yīng)大小目的片段的克隆，測序鑒定正確后得到轉(zhuǎn)移載體pVL1393-ITRs-MCS。

將載體pUC-Cap2用BglⅡ-EcoRⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段cap2，與經(jīng)同樣雙酶切的轉(zhuǎn)移載體pVL1393用T4連接酶連接，重復(fù)上述步驟，測序鑒定正確后獲得轉(zhuǎn)移載體pVL-Cap2。

將載體pUC-Rep2用BglⅡ-XbaⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段rep2，與經(jīng)同樣雙酶切的轉(zhuǎn)移載體pVL1393用T4 DNA連接酶連接，重復(fù)上述步驟，測序鑒定正確后得到轉(zhuǎn)移載體pVL-Rep2。

EGFP、Luc是兩個(gè)較為常用的報(bào)告基因，由于其表達(dá)檢測方便、靈敏度高[17]，本實(shí)驗(yàn)選取這2個(gè)基因作為標(biāo)記基因。EGFP來源于載體pEGFP-N3，Luc來源于載體pGL3-basic。PCR擴(kuò)增[18]獲得基因后分別用BamHⅠ-XbaⅠ和BamHⅠ-EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段EGFP和Luc，與經(jīng)同樣雙酶切處理的轉(zhuǎn)移載體pVL1393-ITRs-MCS用T4連接酶連接，重復(fù)上述步驟，測序鑒定正確后得到轉(zhuǎn)移載體pVL-EGFP和pVL-Luc。

1.3 重組桿狀病毒的構(gòu)建

根據(jù)失活拯救型reBmBac構(gòu)建重組病毒的方法[19]，將適量的轉(zhuǎn)移載體pVL-Luc、pVL-EGFP、pVL-Cap2、pVL-Rep2分別和純化的reBmBac病毒DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞系，27℃培養(yǎng)4～5 d,待細(xì)胞感染發(fā)病并剝落后收集共轉(zhuǎn)染上清液，獲得重組病毒reBm-Luc、reBm-EGFP、reBm-Cap2、reBm-Rep2。

1.4 利用桿狀病毒在家蠶中包裝獲得rAAV2

將上述獲得的重組家蠶桿狀病毒進(jìn)行純化并在細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增、病毒鑒定和病毒滴度測定后，將AAV骨架序列的重組病毒(reBm-Rep2、reBm-Cap2)與報(bào)告基因的重組病毒reBm-Luc、reBm-EGFP分別按等比例混合后注射感染5齡起家蠶幼蟲(105pfu/頭)，在濕度65%、溫度25℃～27℃的條件下培養(yǎng)108～120 h，觀察家蠶發(fā)病情況并收集含有rAAV2表達(dá)產(chǎn)物的蠶血淋巴，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 重組桿狀病毒的PCR鑒定

將重組病毒注射感染正常5齡期基因家蠶幼蟲，獲得重組桿狀病毒表達(dá)的蛋白及復(fù)制的病毒粒子。提取病蠶血淋巴基因組，以其為模板，設(shè)計(jì)特定引物(表1)，通過PCR鑒定目的片段是否重組到病毒基因組中。PCR擴(kuò)增體系(50 μL)：病毒基因組 1 μL，5×Buffer 10 μL，上下游引物各1 μL，dNTP 1 μL，F(xiàn)ast pfu 1 μL，ddH2O 35 μL。PCR程序：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primers.

1.6 家蠶中包裝的rAAV2的純化

將上述實(shí)驗(yàn)收集的蠶血淋巴在-80℃和37℃間反復(fù)凍融4次，用來破碎細(xì)胞；10 000 r/min離心10 min，收集上清即得到rAAV2-EGFP、rAAV2-Luc病毒，60℃加熱30 min以滅活桿狀病毒，于-80℃保存待進(jìn)一步純化。

將收集的含重組腺相關(guān)病毒載體的病毒液，重懸于PBS溶液中，加入1/10體積的氯仿，置于37℃搖床中劇烈振蕩1 h，利用AAV耐氯仿的特性來去除雜蛋白；加入固體氯化鈉至終濃度1 mol/L，振蕩溶解，4℃、12 000 r/min離心15 min， 取出上層水相，棄氯仿和沉淀；加PEG8000至終濃度達(dá)到10%(w/V)，振蕩溶解后冰浴靜置1 h，用來沉淀rAAV病毒顆粒，隨后，11 000 r/min離心15 min，棄上清，用5 mL PBS緩沖液將各離心管管底和管壁上的沉淀吹打洗脫下來合并，再將其分裝至1.5 mL 離心管中，加入DNA酶和RNA酶至終濃度為1～2 μg/mL，室溫下消化30 min。加等體積的氯仿抽提，4℃、11 000 r/min離心5 min，進(jìn)一步去除雜蛋白；將純化的病毒液裝入Milipore濃縮柱(3 kDa)中，6 000～7 000 r/min離心，濃縮為500 μL，即為純化的rAAV2-EGFP和rAAV2-Luc病毒。

1.7 家蠶中包裝的rAAV2的生物活性檢測

將HEK293T細(xì)胞接種到六孔板中(1×105個(gè)/孔)，取100 μL的rAAV2-EGFP、rAAV2-Luc病毒分別置于接種好的細(xì)胞中進(jìn)行孵育，24～48 h內(nèi)觀察綠色熒光蛋白、熒光素酶的表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 含AAV2基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

由轉(zhuǎn)移載體pVL-Cap2、pVL-Rep2、pVL-Luc和pVL-EGFP的酶切鑒定結(jié)果(圖1)可知，pVL-Rep2(BamHⅠ-XbaⅠ)雙酶切后約2 500 bp，pVL-Cap2(EcoR V-EcoRⅠ)雙酶切后約2 900 bp， pVL-Luc(BamHⅠ-EcoRⅠ)雙酶切后約1 700 bp，pVL-EGFP(BamHⅠ-XbaⅠ)雙酶切后約730 bp。電泳條帶大小與目的片段大小一致，說明目的片段成功插入轉(zhuǎn)移載體中，后續(xù)測序也與酶切鑒定結(jié)果一致。

圖1 含AAV2基因轉(zhuǎn)移載體的酶切鑒定Fig.1 Restriction enzyme analysis of transfer vector containing AAV2.A：pVL-Rep2酶切(BamHⅠ-XbaⅠ)；B：pVL-Cap2酶切(EcoRⅤ-EcoRⅠ)；C：pVL-Luc酶切(BamHⅠ-EcoRⅠ)；D：pVL-EGFP酶切(BamHⅠ-XbaⅠ)；M:DNA marker。

2.2 重組桿狀病毒的PCR鑒定

通過同源重組將目的片段cap2、rep2、EGFP和Luc克隆到家蠶桿狀病毒基因中，共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，分別獲得reBm-Cap2、reBm-Rep2、reBm-EGFP和reBm-Luc病毒液。如圖2所示，在2 900 bp、2 500 bp、730 bp和1 700 bp處擴(kuò)增出了與目的片段大小一致的4個(gè)條帶，說明目的片段cap2、rep2、EGFP和Luc成功重組到病毒基因組中，并在家蠶中擴(kuò)增。

圖2 重組桿狀病毒感染家蠶中目的基因PCR鑒定Fig.2 PCR identification of targeted genes in recombinant silkworm baculovirus.

2.3 家蠶中包裝的rAAV2的生物活性檢測

2.3.1家蠶中包裝的rAAV2-EGFP在HEK293T細(xì)胞中的EGFP表達(dá)效果 由圖3(彩圖見封三圖版)可以看出，感染reBm-EGFP的HEK293T細(xì)胞，無綠色熒光，說明reBm-EGFP在該純化過程中已被滅活，不可能產(chǎn)生熒光；感染rAAV2-Luc的HEK293T細(xì)胞和正常的HEK293T細(xì)胞都無綠色熒光，說明正常狀態(tài)的HEK293T細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生熒光，即使感染了攜帶熒光素酶基因的rAAV2也不會(huì)；而感染rAAV2-EGFP的HEK293T細(xì)胞有綠色熒光，說明在家蠶中包裝的rAAV2具有生物學(xué)活性，且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)了EGFP，即表明成功用BmNPV-家蠶表達(dá)系統(tǒng)包裝了rAAV2。

2.3.2家蠶中包裝的rAAV2-Luc在HEK293T細(xì)胞中Luc表達(dá)量的測定 通過比對(duì)采用同樣方法純化的rAAV2-Luc和reBm-Luc感染的樣品中光量子強(qiáng)度的差別(圖4)，可以推斷出采用氯仿純化的方法可以滅活reBm-Luc，即表明成功用BmNPV-家蠶表達(dá)系統(tǒng)包裝了rAAV2。

3 討論

腺相關(guān)病毒是基因治療中常見的病毒載體，因其具有對(duì)人體無害的特性而被廣泛研究。AAV2是研究的最透徹的也是目前研究中最適于基因治療的血清型，目前生產(chǎn)的AAV大多是利用血清2型的rep、ITRs構(gòu)建的假性載體。2型AAV對(duì)骨骼肌、神經(jīng)元、血管平滑肌和肝臟細(xì)胞等都有很好的轉(zhuǎn)染效果。研究還表明，AAV2能夠殺死癌細(xì)胞而不傷害正常細(xì)胞[20]。

圖3 正常HEK293T細(xì)胞及其感染純化rAAV2-EGFP、rAAV2-Luc、reBm-EGFP后的綠色熒光蛋白表達(dá)效果Fig.3 The green fluorescent protein expression of HEK293T cells and after infected with rAAV2-EGFP、rAAV2-Luc and reBm-EGFP.A：正常HEK293T細(xì)胞；B：感染rAAV2-EGFP的HEK293T細(xì)胞；C：感染rAAV2-Luc的HEK293T細(xì)胞；D：感染reBm-EGFP的HEK293T細(xì)胞。(彩圖見封三圖版)

圖4 正常HEK293T細(xì)胞(CK)及其感染純化rAAV2-Luc、reBm-Luc后的相對(duì)光量子強(qiáng)度Fig.4 Relative light unit of HEK293T cells (CK) and after infected with rAAV2-Luc and reBm-Luc.

目前，科研和實(shí)際應(yīng)用中生產(chǎn)rAAV主要是通過非脊椎動(dòng)物細(xì)胞(昆蟲細(xì)胞)獲得的，用AcMNPV-sf表達(dá)系統(tǒng)獲得rAAV需要3個(gè)重組AcMNPV 載體：rBac-Rep、rBac-Cap和rBac-ITR-GFP-ITR，這3個(gè)載體需要同時(shí)感染sf細(xì)胞用以包裝rAAV病毒，利用該方法包裝獲得的rAAV病毒量為104～105vg/cell。而本實(shí)驗(yàn)使用的是BmNPV-家蠶表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)果表明，利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)也可以實(shí)現(xiàn)rAAV2的包裝，且根據(jù)EGFP和Luc的表達(dá)結(jié)果，驗(yàn)證了使用此方法包裝獲得的rAAV2具有感染哺乳動(dòng)物細(xì)胞并驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的能力。利用該表達(dá)系統(tǒng)，理論上在每毫升家蠶血淋巴和每克蠶蛹中的病毒基因組數(shù)目均能達(dá)到1012～1013vg，大大降低了rAAV的包裝成本，進(jìn)而降低了臨床實(shí)驗(yàn)和應(yīng)用的成本，即其具有AcMNPV-sf表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)同時(shí)表達(dá)量更高，且生產(chǎn)成本低幾百倍[21]。因此，用BmNPV-家蠶系統(tǒng)包裝rAAV也有可能獲得比昆蟲細(xì)胞高得多的產(chǎn)量，是一個(gè)比較理想的生產(chǎn)rAAV的系統(tǒng)。但與sf細(xì)胞相比，由于家蠶含有較多的非目的蛋白，所以其純化過程會(huì)更加繁瑣，即在實(shí)際操作中，使用氯仿純化的方法會(huì)降低rAAV表達(dá)量。

目前尚無利用家蠶表達(dá)系統(tǒng)包裝rAAV的相關(guān)報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)證明了rAAV能夠在家蠶表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，為后續(xù)用單家蠶桿狀病毒包裝rAAV，從而實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模的生產(chǎn)，提供了理論基礎(chǔ)。但本研究中所用的三載體表達(dá)包裝策略的效率較單載體策略要低很多，且后續(xù)包裝操作方法較為繁瑣。2012年，Galibert等[22]開發(fā)出了單桿狀病毒包裝系統(tǒng)，將rep、cap基因和目的基因表達(dá)盒分別插入AcMNPV基因組的egt和polyhedrin基因等位點(diǎn)，構(gòu)建一個(gè)重組桿狀病毒，這樣用一個(gè)重組病毒即可制備出rAAV載體。與三載體和雙載體體系相比，單載體策略的表達(dá)量顯著提高，是雙載體系統(tǒng)的6倍以上、三載體系統(tǒng)的60倍以上，且其穩(wěn)定性也有提高。以后研究使用家蠶桿狀病毒包裝rAAV時(shí)，可參考Galibert等[22]，用單家蠶桿狀病毒來包裝rAAV，從而獲得更高的包裝效率。

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