氣質(zhì)質(zhì)聯(lián)用法測定水產(chǎn)品中50種農(nóng)藥殘留量

高堯華，劉冰，滕爽，劉培海，孫燦

（1.日照出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東日照276826；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京210095）

近年來，由于農(nóng)藥的大量使用導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)問題頻頻出現(xiàn)，農(nóng)藥殘留對(duì)食品安全性及人類健康產(chǎn)生的負(fù)面作用日益凸顯出來[1]。隨著農(nóng)藥的長期使用，農(nóng)藥類型的增多，一些化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的農(nóng)藥不僅殘留于植物源性食品中，也污染了環(huán)境[2]，同時(shí)通過食物鏈進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)，從而進(jìn)一步危害人類的健康?，F(xiàn)階段動(dòng)物源性食品中的農(nóng)藥殘留問題正逐漸受到各國政府及公眾的廣泛關(guān)注。為此，許多國家和地區(qū)都制定了嚴(yán)格的動(dòng)物源性食品中農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。我國目前已針對(duì)進(jìn)出口水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留含量制定了嚴(yán)格的食品安全監(jiān)控計(jì)劃和監(jiān)控措施。

目前食品中農(nóng)藥殘留常用的檢測方法有氣相色譜法[3-4]、液相色譜法[5-6]、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]等，但氣相色譜法和液相色譜法在檢測器的靈敏度及確證檢測技術(shù)上存在不足，現(xiàn)行的農(nóng)藥多殘留快速篩查檢測技術(shù)主要以色譜－質(zhì)譜聯(lián)用為主，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法成本高、環(huán)境污染更嚴(yán)重，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度低于氣相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法。在樣品前處理過程中為了降低共提取物的干擾，滿足高靈敏度的檢測，樣品提取后需要進(jìn)一步凈化，在凈化過程中含油脂樣品常用的凈化方法有凝膠滲透色譜法、固相萃取柱凈化法、QuEChERS方法等[11]，凝膠滲透色譜法在使用過程中溶劑消耗量大、時(shí)間長，容易造成環(huán)境污染和試劑浪費(fèi)[12]。固相萃取柱凈化法對(duì)有些樣品凈化效果不理想。QuEChERS方法又因簡單、快速、可以有效處理大批量樣品而廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留分析、獸藥殘留分析、以及環(huán)境污染物的分析等領(lǐng)域[13-17]。根據(jù)樣品特點(diǎn)及檢測項(xiàng)目的不同，國內(nèi)外專家對(duì)QuEChERS方法中材料配比進(jìn)行了深入的研究[18-22]。但含油脂類樣品的前處理方法仍在不斷探索、改進(jìn)中，特別是鮭魚、對(duì)蝦等水產(chǎn)品的前處理方法，都存在樣品前處理凈化效果差、提取率低等問題。

針對(duì)上述問題，本文對(duì)水產(chǎn)品中含有油脂的魚類和蝦類樣品的前處理方法進(jìn)行研究，結(jié)合氣相色譜/串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜，建立了鮭魚、對(duì)蝦等水產(chǎn)品中50種農(nóng)藥殘留的分析方法。本方法操作簡便、快捷、重現(xiàn)性好、精密度高，適用于水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的定性與定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜/串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（Agilent7890A-7000B GC-MS/MS）：美國安捷倫公司；IKA T18均質(zhì)器、IKA KS260振蕩器、IKA MS3 basic渦旋混勻器：德國IKA公司；氮吹儀（Biotage）：美國Turbovap公司；離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；C18、乙二胺－N－丙基烷（PSA）、石墨化炭黑（GCB）：天津艾杰爾股份有限公司。

乙腈（色譜純）：美國TEDIA；丙酮和正己烷（色譜純）：德國Merck；氯化鈉（分析純）：西隴化工股份有限公司；50種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品為農(nóng)業(yè)部有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（質(zhì)量濃度均為 100 μg/mL）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確移取安碚瓶內(nèi)1 mL（規(guī)格為100 μg/mL）50種標(biāo)準(zhǔn)品單品，用丙酮+正己烷（3+7，體積比）配制成10 μg/mL單品種的儲(chǔ)備液，在-18℃冰箱避光、密封保存，保存期為半年。

1.3 儀器工作條件

GC/MS/MS：色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣：高純氦氣（99.999%）；碰撞氣：高純氮（99.999%）；流速：3.8 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；柱溫：初始70℃（2 min）以25℃/min程序升溫至150℃，再以3℃/min程序升溫至200℃，最后以8℃/min程序升溫至280℃（2 min）；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣量 1.0 μL；離子源：EI源；離子源溫度：300℃；輔助加熱溫度：280℃；溶劑延遲：5 min。

1.4 樣品前處理

魚肉試樣：稱取10.0 g魚肉試樣，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈均質(zhì)提取2 min，加入5 g氯化鈉，振蕩30 min，放置于-18℃冷藏1.5 h，以5 000 r/min離心5 min，取上清液15 mL，加入450 mg PSA、450 mg C18、50 mg GCB，渦旋 30 s，以 5 000 r/min 離心 5 min，取上清液10 mL氮?dú)獯抵两桑瑴?zhǔn)確加入1.0 mL丙酮+正己烷（30+70，體積比）定容后，過0.22 um濾膜，供上機(jī)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

農(nóng)藥類化合物可溶于多種有機(jī)試劑，正己烷、丙酮、正己烷與丙酮混合溶液、乙酸乙酯、乙腈、加入酸性緩沖溶液的乙腈等多種溶劑，而農(nóng)殘的提取方式也有超聲波提取、均質(zhì)、振蕩等方法。經(jīng)過多次試驗(yàn)，該類產(chǎn)品先均質(zhì)后振蕩提取回收率更高。經(jīng)過試驗(yàn)對(duì)比上述提取溶劑，正己烷、乙酸乙酯在提取過程中，油脂含量太高，不宜凈化，而且回收率較低，丙酮、以及丙酮與正己烷的混合溶液提取過程中易帶入水分，在氮?dú)獯蹈蛇^程中不易吹干，即使少量水分進(jìn)入色譜柱內(nèi)也會(huì)對(duì)色譜柱造成損害，同時(shí)提取過程中也會(huì)帶入油脂，從而增加了凈化難度。對(duì)比乙腈及加入酸性緩沖溶液的乙腈作為提取液，酸化乙腈難以兼顧50種農(nóng)藥化合物的回收率，特別是酸性條件下不穩(wěn)定的化合物，回收率低至60%以下，難以達(dá)到方法學(xué)指標(biāo)。因此，經(jīng)過試驗(yàn)最終確定乙腈為提取溶液，采取先均質(zhì)后振蕩的提取方式進(jìn)行提取。

2.2 凈化方式的選擇

鮭魚類產(chǎn)品油脂含量高，在前處理過程中出現(xiàn)大量油脂不宜吹干，在色譜圖中油脂峰明顯，對(duì)檢測產(chǎn)生干擾影響定量準(zhǔn)確性，對(duì)色譜柱的損害也較大。本文對(duì)幾種常用的農(nóng)殘凈化方式進(jìn)行了對(duì)比。其譜圖見圖1。

從圖1中可以看出，未凈化樣品中有明顯的雜質(zhì)峰，經(jīng)固相萃取柱凈化后，油脂峰去除效果不明顯，本試驗(yàn)方法凈化效果最佳。該方法有效減少共提取物中的油脂，而且回收率與其它方法相比平均高5%～26%。在樣品凈化過程中，在對(duì)比試驗(yàn)中用PSA/C18復(fù)合固相萃取柱凈化與QuECHERS方法中PSA、C18粉末相比凈化效果更差。這與植物源性高油脂類樣品的凈化不同，動(dòng)物油脂的成分與PSA、C18粉末充分接觸后能夠更充分被吸附，水產(chǎn)品更適合該凈化方式。

也有多篇文獻(xiàn)報(bào)道QuECHERS的提取、凈化方法，在試驗(yàn)過程中加入硫酸鎂、氯化鈣等物質(zhì)，在凈化過程中加入不同量的PSA、C18、GCB[19-22]。本試驗(yàn)對(duì)各物質(zhì)及比例進(jìn)行了探討，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入硫酸鎂、氯化鈣等物質(zhì)可以快速使溶劑層與水相分離，但部分有機(jī)磷農(nóng)藥回收率下降，其中乙酰甲胺磷回收率下降最多，回收率不足50%。對(duì)凈化過程中各物質(zhì)比例進(jìn)行試驗(yàn)后，本方法中水產(chǎn)品的樣品量與PSA、C18、GCB粉末質(zhì)量比例最佳，經(jīng)提取、凈化后即能夠兼顧凈化效果又可以滿足50種農(nóng)藥的提取率。各類農(nóng)藥回收率均在65%以上，回收率滿足GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢驗(yàn)》的要求，凈化后共提取物中的干擾組分可以有效去除。此外，試驗(yàn)對(duì)比了冷凍與不冷凍的前處理方式，發(fā)現(xiàn)冷凍后，干擾組分明顯減少，油脂去除更徹底。

2.3 濃縮過程對(duì)結(jié)果的影響

試驗(yàn)分別考察了標(biāo)準(zhǔn)溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)和氮?dú)獯抵两傻臐饪s方法，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮?dú)獯蹈傻臐饪s過程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大。結(jié)果表明，大部分農(nóng)藥化合物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收率要低于氮?dú)獯蹈傻幕厥章?，乙酰甲胺磷、溴氰菊酯的回收率下降最大，乙酰甲胺磷、溴氰菊酯通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)方法比氮?dú)獯抵两傻幕厥章氏陆?2%～30%。而氮?dú)獯蹈蛇^程中吹的時(shí)間越長、越干，目標(biāo)物的回收率越低。為確保試驗(yàn)回收率本文采用氮?dú)獯蹈傻姆椒?，氮?dú)獯抵两杉礋o明顯液滴流動(dòng)為止。

2.4 GC-MS/MS方法的建立

將50種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液配置為5 μg/mL的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描，確定每種農(nóng)藥的保留時(shí)間，并從每種農(nóng)藥的一級(jí)質(zhì)譜圖中選擇豐度高、m/z大的母離子碎片，在不同碰撞能量下對(duì)母離子進(jìn)行碰撞解離，選擇靈敏度高的兩對(duì)離子為子離子，其中一對(duì)離子對(duì)作為定量離子，另一對(duì)作為定性離子。50種農(nóng)藥的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜條件、檢出限見表1。

氣相色譜/三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測0.10 μg/mL 50種農(nóng)藥化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液所得總離子流圖見圖2。

表1 50種農(nóng)藥的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜條件、檢出限Table 1 Retention times，MRM conditions and limits of detection（LOD）for 50 pesticides

續(xù)表1 50種農(nóng)藥的色譜保留時(shí)間、質(zhì)譜條件、檢出限Continue table 1 Retention times，MRM conditions and limits of detection（LOD）for 50 pesticides

圖2 溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.10 μg/mL）在MRM模式下的總離子流圖Fig.2 Total ion current chromatogram of the matrix standard（0.10 μg/mL）under MRM mode

50種化合物的出峰順序分別是：1.敵敵畏、2.甲胺磷、3.久效磷、4.速滅磷、5.乙酰甲胺磷、6.滅線磷、7.殺蟲脒、8.硫線磷、9.甲拌磷、10.α-BHC、11.特丁硫磷、12.β-BHC、13.二嗪磷、14.嘧霉胺、15.γ-BHC、16.δ-BHC、17.乙草胺、18.七氯、19.甲基毒死蜱、20.甲基對(duì)硫磷、21.甲草胺、22.莠滅凈、23.磷胺、24.馬拉硫磷、25.毒死蜱、26.倍硫磷、27.對(duì)硫磷、28.水胺硫磷、29.甲基異柳磷、30.喹硫磷、31.氟蟲腈、32.多效唑、33.4，4-DDE、34.溴蟲腈、35.2，4-DDT、36.4，4-DDD、37. 三唑磷、38.4，4-DDT、39.聯(lián)苯菊酯、40.甲氰菊酯、41.雙甲脒、42.三氟氯氰菊酯、43.氯菊酯、44.氟氯氰菊酯、45.蠅毒磷、46.氯氰菊脂、47.氟氰戊菊酯、48.氰戊菊酯、49.苯醚甲環(huán)唑、50.溴氰菊酯。

2.5 線性范圍與檢出限

分別在鮭魚與對(duì)蝦中添加0.01 mg/kg的50種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理提取凈化后，用溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液分別做標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，對(duì)添加樣品進(jìn)行校正計(jì)算，經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樣品基質(zhì)對(duì)部分分析物的影響較大，其中甲胺磷、甲基毒死蜱、甲基對(duì)硫磷、磷胺、馬拉硫磷、對(duì)硫磷、水胺硫磷、喹硫磷、三唑磷、蠅毒磷，用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線校正后回收率在140%～320%之間，而用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校正后回收率在65%～118%之間，符合方法學(xué)驗(yàn)證指標(biāo)。為了最大限度降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高定性、定量分析的準(zhǔn)確度，本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液做工作曲線。

根據(jù)添加空白樣品的3倍信噪比確定方法的檢出限（LOD，S/N=3），10 倍信噪比（LOQ，S/N=10）確定方法的定量限。鮭魚、對(duì)蝦中50種農(nóng)藥化合物檢出限為0.001 mg/kg～0.005 mg/kg，該方法的靈敏度可滿足我國農(nóng)藥殘留的監(jiān)控要求。用基質(zhì)溶液配制了0.050、0.10、0.20、0.50、1.0 μg/mL的50種農(nóng)藥化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液。以目標(biāo)組分的峰面積y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x（μg/mL），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性相關(guān)系數(shù)大于 0.99（r2＞0.99），表明50種農(nóng)藥在氣相色譜/串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法檢測中具有較好的線性關(guān)系。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度

選取空白鮭魚和對(duì)蝦等產(chǎn)品，分別添加0.010、0.020、0.100 mg/kg 3個(gè)濃度的50種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4樣品前處理的方法提取、凈化、上機(jī)，每個(gè)濃度做平行試驗(yàn)6次，測得鮭魚和對(duì)蝦中回收率在65%～118%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.74%～12.3%之間，精密度和準(zhǔn)確度均達(dá)到GB/T 27404-2008中農(nóng)藥殘留檢測的要求。并且與其他方法相比回收率高，精密度好見表2。

表2 50種農(nóng)藥在2種基質(zhì)中的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations（RSDs）for 50 pesticides in 2matrix（n=6）

3 結(jié)論

本文研究建立了鮭魚、對(duì)蝦等水產(chǎn)品中50種農(nóng)藥殘留量檢測的氣相色譜/串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜分析方法。該方法采用乙腈提取，凈化，配基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)法定量，實(shí)現(xiàn)了水產(chǎn)類樣品中50種農(nóng)藥殘留含量的確證及定量分析，并且該方法回收率高，精密度好，適用性強(qiáng)、簡單快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均能滿足水產(chǎn)類樣品日常分析檢測的要求，同時(shí)為食品安全領(lǐng)域提供了重要的技術(shù)支持。

[1]張愛芝,王全林,曹麗麗,等．QuECHERS－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中250種農(nóng)藥殘留[J].色譜,2016,34(2):158－164

[2]林濤,邵金良,劉興勇,等．QuECHERS－超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中41種農(nóng)藥殘留[J].色譜,2016,33(3):235－241

[3]胡業(yè)琴,郗存顯,曹淑瑞,等．介孔氧化鋁凈化-氣相色譜法同時(shí)測定蔬菜、水果及茶葉中16種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留[J].色譜,2014,32(7):784-788

[4]胡強(qiáng),王延云,王燕,等.氣相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)測定綠茶中28種農(nóng)藥殘留[J].食品研究與開發(fā),2017,38(1):152-157

[5]侯如燕,卞紅正,趙秀霞,等．固相萃取-液相色譜測定復(fù)雜基質(zhì)蔬菜中9種煙堿類殘留[J].分析測試學(xué)報(bào),2011,30(1):58-63

[6]Melo A,Aguiar A,Mansilha C,et al.Optimisation of a solid-phase microextraction/HPLC/Diode array method formultiple pesticide screening in lettuce[J].Food Chem,2012,130(4):1090-1097

[7]郭春景,李娜,王建忠．超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定8種蔬菜中114種農(nóng)藥殘留[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2014,35(3):279-288

[8]柳菡,徐錦忠,丁濤,等．蔬菜中26種農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定[J].分析測試學(xué)報(bào),2009,28(2):181-185

[9]葛娜,劉曉茂,李學(xué)民,等．氣相色譜-質(zhì)譜法測定蔬菜與水果中11種三唑類農(nóng)藥殘留[J].分析測試學(xué)報(bào),2012,30(12):1351-1355

[10]陳紅平,劉新,汪慶華,等．氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測水果、蔬菜中抗蚜威、甲霜靈和克螨特殘留量[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào),2010,31(4):220-223

[11]李凱,劉永強(qiáng),張金玲,等．DPX-Q萃取吸管結(jié)合氣相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測水果蔬菜中102種農(nóng)藥殘留[J].分析試驗(yàn)室,2015,34(2):236-242

[12]Anastassiades M,S J Lehotay,Stajnbaher D,et al.Fast and easymultiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning anddispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residuesin produce[J].AOAC Int,2003,86(2):412-431

[13]Stubbings G,Bigwood T.The development and validation of a multiclassliquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)procedurefor the determination of veterinary drug residues in animal tissue using aQuEChERS(quick easy,cheap,effective,rugged and safe)approach[J].Anal Chim Acta,2009,637(1/2):68-78

[14]He Z Y,Wang L,Peng Y,et al.Determination ofselected polychlorinated biphenyls in soil and earthworm (Eisenia fetida)using a QuEChERS-based method and gas chromatography with tandem MS[J].Sep Sci,2015,38(21):3766-3773

[15]Gang W,Xiao X B b,Shan H Z,et al.Analysis of multi-pesticide residues in the foods of animal origin by GC-MS coupledwith accelerated solvent extraction and gel permeation chromatography cleanup[J].Food Chem,2011,126(4):646-654

[16]Cunha S C,Lehotay S J,Mastovska K,et al.Oliveira,Evaluation of the QuEChERS sample preparation approach for the analysis ofpesticide residues in olives[J].Sep Sci,30 2007,30(4):620-632

[17]S S Herrmann,M E Poulsen.Clean-up of cereal extracts for gaschromatography-tandem quadrupole mass spectrometry pesticide residuesanalysis using primary secondary amine and C18[J].Chromatogr.A,2015,1423(12):47-53

[18]Koesukwiwat U,Lehotay S J,Mastovska K,et al.Leepipatpiboon,Extension of the QuEChERS method for pesticide residues in cereals toflaxseeds,peanuts,and doughs[J].Agric Food Chem,2010,58(10):5950-5958

[19]Lehotay S J,Mastovska K,Yun S J.Evaluation of two fast and easy methods for pesticide residue analysis in fatty food matrixes[J].AOAC Int,2005,88(2):630-638

[20]Walorczyk S.Development of a multi-residue method for the determinationof pesticides in cereals and dry animal feed using gas chromatography-tandem quadrupole mass spectrometry II.Improvementand extension to new analytes[J].Chromatogr A,2008,1208(2):202-214

[21]Li J H,Jessie M,Yelena S,et al.Evaluation of a recent product to remove lipids and other matrixco-extractives in the analysis of pesticide residues and environmentalcontaminants in foods[J].Chromatogr A,2016,1449(6):17-29

[22]Hans R N,Agnethe C,Ermias D.Application of QuEChERS method for extraction of selected persistent organicpollutants in fish tissue and analysis by gas chromatography mass spectrometrys[J].Chromatogr A,2011,1218(41):7234-7241