過表達(dá)miR-15b對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的影響

栗曉亮楊 明黃 麗孫華欽許文明伍春蓮

（1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009；2.四川大學(xué)華西第二醫(yī)院 四川大學(xué)-香港中文大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室教育部出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041）

0 引 言

MicroRNAs（miRNAs）是一類調(diào)控基因表達(dá)，自身不參與基因編碼的非編碼RNA分子，長度在22個(gè)堿基左右。雖然miRNA不參與編碼蛋白質(zhì)，但是可通過結(jié)合目的mRNA的3'端非翻譯區(qū)（3'UTR），在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[1-2]。前人研究顯示miRNA對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡，血管生成和腫瘤發(fā)生等現(xiàn)象具有重要作用[3-5]。此外，miRNA還可以調(diào)節(jié)早期的胚胎發(fā)育過程。斑馬魚做為動(dòng)物研究的經(jīng)典模式生物，具有通體透明，發(fā)育周期短，操作方便等優(yōu)點(diǎn)；因此，研究miRNA在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的作用成為了關(guān)注熱點(diǎn)。

miR-15b屬于miR-15/107組群中的一員，核酸序列在不同的物種之間具有相對(duì)保守性。在人類的各種組織器官均可檢測到miR-15/107家族[6]的存在，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的組織特異性（空間特異性），但是Bruchova[7]和Nelson[8]針對(duì)miR-15/107家族做表達(dá)譜的篩查時(shí)，發(fā)現(xiàn)在紅細(xì)胞生成和大腦發(fā)育過程中miR-15/107家族有發(fā)育階段特異性（時(shí)間特異性）。目前研究結(jié)果表明，miR-15b在B細(xì)胞惡性腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌、胃癌和肺腺癌等人類惡性腫瘤疾病中表達(dá)降低，并且可以作為治療癌癥預(yù)后判斷的分子靶標(biāo)[9-12]。在膠質(zhì)瘤中miR-15b可以靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白（cyclin），從而調(diào)控細(xì)胞周期過程[13]；在肝癌和胃癌細(xì)胞中miR-15b與Bcl-2的基因表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，即可以通過過表達(dá)miR-15b下調(diào)Bcl-2而誘發(fā)癌細(xì)胞的凋亡[14-16]。此外，還有研究證明，在人參皂苷促進(jìn)血管形成過程中miR-15b通過靶向降解血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2（VEGFR2）的mRNA，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞血管的形成[17]。目前尚無miR-15b在斑馬魚的早期胚胎發(fā)育和后期血管形成過程中的功能研究。

本研究利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚（VEGFR2：GFP）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過尼康體視顯微鏡進(jìn)行表型觀察，可在體觀察血管的發(fā)育情況，運(yùn)用全胚原位雜交（whole mountin situhybridization）、蛋白免疫印跡（western blot）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測（dual-fluorescence reporter system）等技術(shù)手段，研究探索miR-15b對(duì)斑馬魚血管發(fā)育的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用轉(zhuǎn)基因斑馬魚為血管綠色熒光標(biāo)記斑馬魚（VEGFR2：GFP），飼養(yǎng)3個(gè)月后即可產(chǎn)卵。每天定時(shí)添加咸水豐年蟲充作飼料，照明14h黑暗10h交替，待其能夠產(chǎn)出健康魚卵后，將雌雄斑馬魚放入交配缸內(nèi)，次日早上 8：00～10：00 時(shí)產(chǎn)卵后，將胚胎收集到含有小魚水的培養(yǎng)皿中，于28℃培養(yǎng)。

試驗(yàn)用HEK293細(xì)胞及所用質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚全胚原位雜交

將不同發(fā)育時(shí)期的斑馬魚胚胎剝?nèi)ヂ涯ぃ占?.5mL RNA-Free的EP管中，每管加入10～50個(gè)斑馬魚胚胎，利用4%多聚甲醛（PFA）溶液固定過夜（至少12h）。梯度甲醇/PBST水合、蛋白酶K消化后，再使用4%PFA固定10min。棄掉固定液，用PBST洗滌3次，然后在預(yù)雜交液中，58℃預(yù)雜交3h。接著置于含 20～80 nmol/L 探針（購買自exiqon，Denmark，序列TGTAAACCATGTGCTGCTA）的雜交液中，58℃雜交過夜。于58℃使用2×SSC和0.2×SSC依次洗去未結(jié)合的探針，再于室溫下經(jīng)梯度0.2×SSC/PBST溶液洗滌，以含山羊血清的PBST溶液室溫封閉探針3h；在稀釋5 000倍的抗地高辛抗體（anti-Dig-AP）中，4℃孵育過夜；之后用1×PBST溶液洗去未結(jié)合的抗體，然后加入顯色溶液（NBT+BCIP溶液）顯色1 h，用終止液快速洗去多余的顯色液，在尼康體視顯微鏡下觀察拍照并記錄。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

人胚腎細(xì)胞HEK-293培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)皿置于5%CO2、37℃的孵育箱內(nèi)。

miR-15b mimic（miR10000784-1-5）購買自銳博生物。

1.2.3 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)

從不同處理組的293細(xì)胞中提取總蛋白，使用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量檢測，使用5×SDS在99℃下煮10min變性處理，調(diào)整蛋白上樣量一致。用8%的SDS-PAGE凝膠60V恒壓30min，進(jìn)入分離膠后90V恒壓90min后，將蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜80 V恒壓2 h。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（anti-VEGFR2 1∶5000；anti-VEGFa 1∶5000；anti-βtubulin 1∶10 000）4℃孵育過夜，1×TBST 洗膜 3 次，二抗使用偶聯(lián)辣根過氧化物酶HRP的抗鼠或兔的抗體（1∶10 000）室溫孵育 1 h，TBST 洗 3 次，HRP 底物ECL發(fā)光液沖淋PVDF膜5min，曝光結(jié)果呈現(xiàn)于X光膠片。

1.2.4 雙熒光素酶活性檢測

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析與作圖，圖表數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SEM）呈現(xiàn)。*表示P＜0.05為顯著差異；**表示P＜0.01為極顯著差異；***表示P＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 miR-15b在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空特異性表達(dá)

本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用斑馬魚全胚原位雜交檢測miR-15b在斑馬魚胚胎發(fā)育不同時(shí)期的時(shí)間和空間分布。檢測結(jié)果見圖1，藍(lán)色熒光區(qū)域表明miR-15b在胚胎發(fā)育早期高水平表達(dá)，隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，miR-15b表達(dá)水平逐步降低，到24 hpf（hours post-fertilization），檢測信號(hào)減弱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-15b可能是母源性分子，推測其可能影響斑馬魚胚胎的發(fā)育。

2.2 過量表達(dá)miR-15b導(dǎo)致斑馬魚血管發(fā)生阻滯

本實(shí)驗(yàn)利用血管綠色熒光標(biāo)記斑馬魚（VEGFR2：GFP）模型，研究miR-15b在斑馬魚胚胎發(fā)育后期對(duì)血管形成能力的影響。將miR-15b MO注射到斑馬魚受精卵內(nèi)，在胚胎發(fā)育早期過量表達(dá)miR-15b。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見圖2），VEGFR2在斑馬魚整個(gè)血管系統(tǒng)內(nèi)均有表達(dá)，在過量表達(dá)miR-15b處理組的斑馬魚中，VEGFR2在血管中的表達(dá)較弱于陰性對(duì)照miR-15b control處理組，并且實(shí)驗(yàn)組斑馬魚表現(xiàn)出血管系統(tǒng)的發(fā)育畸形（58.4%）遠(yuǎn)大于陰性對(duì)照組的斑馬魚畸形胚胎率18.7%（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還揭示了在血管發(fā)育畸形的斑馬魚心臟周圍沒有出現(xiàn)血管簇。

2.3 miR-15b對(duì)VEGFR2表達(dá)的影響

由于過表達(dá)miR-15b會(huì)對(duì)斑馬魚血管系統(tǒng)有影響，因此在HEK-293細(xì)胞內(nèi)研究miR-15b對(duì)VEGFR2的具體作用機(jī)制。分別將miR-15b mimic和miR-15b inhibitor轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞體內(nèi)，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（見圖 3（a），圖 3（b）），VEGFR2 基因表達(dá)水平與miR-15b基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性，即抑制miR-15b的表達(dá)可以升高VEGFR2的表達(dá)水平，提高miR-15的表達(dá)則降低VEGFR2的表達(dá)水平。為了證明miR-15b可以靶向調(diào)控VEGFR2 mRNA水平，構(gòu)建了含有VEGFR2 mRNA 3'UTR的pGL3-basic質(zhì)粒，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測技術(shù)，分別將miR-15b mimic，mimic control與 VEGFR2 mRNA 3'UTR 共同轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞48 h后進(jìn)行檢測。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示（見圖3（c）），過量表達(dá)miR-15b后螢火蟲熒光值/海腎熒光值比對(duì)照組降低了57.2%，結(jié)果提示miR-15b可能通過靶向結(jié)合VEGFR2 mRNA 3'UTR來調(diào)控VEGFR2的表達(dá)。

圖1 miR-15b在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的時(shí)空表達(dá)

圖2 斑馬魚胚胎過表達(dá)miR-15b影響斑馬魚血管發(fā)育

圖3 miR-15b結(jié)合VEGFR2 mRNA的3'UTR區(qū)調(diào)控VEGFR2的表達(dá)

3 結(jié)束語

miRNA對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、血管生成以及腫瘤發(fā)生等功能具有重要作用。miR-15b通過影響不同基因mRNA的穩(wěn)定性，從而在基因轉(zhuǎn)錄后改變相應(yīng)基因的表達(dá)水平，最終決定斑馬魚胚胎發(fā)育的生命歷程。斑馬魚作為胚胎發(fā)育研究的經(jīng)典模式生物，已經(jīng)有miRNA在斑馬魚胚胎發(fā)育的表達(dá)譜研究[18]，但是關(guān)于miR-15b對(duì)斑馬魚早期胚胎的發(fā)育過程中的功能研究報(bào)道較為少見，因此本研究對(duì)miR-15b對(duì)斑馬魚胚胎早期胚胎發(fā)育的影響做了一定的基礎(chǔ)研究。

本研究利用斑馬魚全胚原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-15b在斑馬魚胚胎早期表達(dá)水平最高并且廣泛存在，隨發(fā)育的進(jìn)行，miR-15b的探針信號(hào)逐漸減弱。說明miR-15b是母源性分子并且不具有空間特異性，這與Finnerty[6]研究miR-15家族在人類組織中的分布一致。有報(bào)道m(xù)iR-15b[16]調(diào)控細(xì)胞凋亡和血管生成，進(jìn)而導(dǎo)致心血管疾病，由此推測miR-15b或許會(huì)影響斑馬魚早期胚胎血管生成過程中有關(guān)基因的功能。

本研究利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚（VEGFR2：GFP）為模式動(dòng)物，在體內(nèi)研究了miR-15b對(duì)斑馬魚血管系統(tǒng)早期發(fā)育的影響。通過注射miR-15b的類似物導(dǎo)致斑馬魚胚胎血管發(fā)育畸形，證實(shí)miR-15b的表達(dá)異?？蓪?dǎo)致斑馬魚血管系統(tǒng)發(fā)育異常。體外細(xì)胞研究結(jié)果表明，miR-15b通過調(diào)節(jié)VEGF下游信號(hào)通路分子VEGFR2影響血管系統(tǒng)發(fā)育，提示miR-15b的正常表達(dá)是斑馬魚胚胎發(fā)育良好的重要保證之一。

斑馬魚胚胎的正常發(fā)育過程需要不同的基因間精細(xì)而又復(fù)雜的調(diào)控[19]，斑馬魚胚胎的發(fā)育包括胚胎三胚層的分化，器官的發(fā)育和體節(jié)的形成等，需要包括Bmp，Wnt和RA等信號(hào)通路參與調(diào)控。miR-15b通過調(diào)節(jié)VEGF下游信號(hào)通路分子VEGFR2影響血管系統(tǒng)發(fā)育，為miRNA影響血管發(fā)育的機(jī)制提供了新的參考。miR-15b是否還參與調(diào)控了其他信號(hào)通路需要進(jìn)一步的深入研究。之后將繼續(xù)圍繞miR-15b尋找其他的靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，逐漸揭露miR-15b在斑馬魚胚胎早期發(fā)育中的作用機(jī)制。

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