四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中乳酸菌的分離鑒定及其抗氧化能力研究

田圓圓，劉絨梅，耿 琦，史健陽，張國建，孫 群

（四川大學生命科學學院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610064）

0 引 言

四川傳統(tǒng)腌臘肉制品因其獨特的風味受到廣大消費者的喜愛。四川傳統(tǒng)腌臘肉制品屬于自然發(fā)酵肉制品，依賴于原料肉和加工環(huán)境中的微生物群[1]；因此，其中存在豐富的具有地域特色的微生物菌種資源。

腌臘肉制品中存在廣泛的氧化反應(yīng)，包括脂肪氧化和蛋白氧化。適度的氧化對產(chǎn)品風味和滋味的形成有重要貢獻，但過度的脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化會影響產(chǎn)品的質(zhì)量，給產(chǎn)品帶來持水性降低、質(zhì)構(gòu)變差、顏色變暗、風味變差等問題[2-3]。因此，減緩腌臘肉制品的氧化反應(yīng)，對保證產(chǎn)品質(zhì)量和延長貨架期具有重要意義。阻斷肉與肉制品中的自由基反應(yīng)是減緩氧化的最有效途徑之一。現(xiàn)如今，大部分抗氧化劑來自化學合成和天然物質(zhì)的提取，但是化學合成的抗氧化劑可能會生成新的自由基造成產(chǎn)品氧化[4]，而天然抗氧化物質(zhì)又有提取純化過程較復雜的缺點。已有研究表明，某些乳酸菌具有抗氧化的能力，乳酸菌具有生長周期短、安全和價格低廉的優(yōu)勢[5]。

乳酸菌是發(fā)酵肉制品中的主導微生物，對發(fā)酵肉制品的質(zhì)量和安全起著至關(guān)重要的作用[6]，乳酸菌在發(fā)酵肉制品中的作用得到了廣泛的研究。用于發(fā)酵肉制品的乳酸菌的主要發(fā)酵特征需要滿足肉類發(fā)酵劑要求，即具有蛋白酶和脂肪酶活性，不產(chǎn)NH3、生物胺、H2S和CO2，能夠耐受6%NaCl和150mg/kg NaNO2，以及能夠在10～30℃生長等[7]。已有的研究表明某些乳酸菌具有抗氧化能力，通常具有抗氧化能力的乳酸菌具有清除羥自由基和二苯苦味肼基（DPPH自由基）能力，以及還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力。如從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的Lactobacillus plantarum對羥自由基和二苯苦味肼基的清除率分別達到44.31%和53.05%[8]，從哈爾濱紅腸中分離的Pediococcus pentosaceus能夠清除羥自由基和DPPH自由基，具有還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力，并且能夠顯著降低發(fā)酵香腸的脂肪氧化和蛋白質(zhì)氧化程度[4]。同樣L.fermentum具有清除羥自由基和DPPH自由基的能力[9]。

本研究從采集于四川多個地區(qū)的7種農(nóng)家自制傳統(tǒng)腌臘肉制品中篩選乳酸菌，通過16S rDNA測序?qū)Y選菌株進行鑒定，并檢測篩選菌株的主要發(fā)酵特征，對主要發(fā)酵特征滿足肉類發(fā)酵要求的菌株，進一步檢測其清除羥自由基、DPPH自由基的能力，還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力，以評價其抗氧化能力。從而篩選出有望應(yīng)用于發(fā)酵肉制品并減緩產(chǎn)品氧化的潛力菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一共7個樣品采集于四川省多個地區(qū)農(nóng)戶，包括四川省眉山市、都江堰市、成都市、資陽市和宜賓市。樣品采集后于4℃保存，2d內(nèi)進行篩菌實驗。

引物27F、1492R合成于Invitrogen（上海）貿(mào)易有限公司；細菌DNA提取試劑盒，北京天根公司；亞硝酸鈉、精氨酸、半胱氨酸、醋酸鉛、溴甲酚紫、石蕊、中性紅、乙酸鈉、蛋白胨、吐溫80、葡萄糖、酵母浸粉、氯化鈉等生化試劑，均購自成都金蜀都化驗設(shè)備有限公司。鄰二氮菲、DPPH、亞油酸、抗壞血酸，購于成都云德科技有限公司。

MRS培養(yǎng)基按文獻[4]配制：10 g蛋白胨、10 g牛肉膏、5 g酵母浸粉、20 g葡萄糖、5 g乙酸鈉、2 g K2HPO4、2 g 檸 檬 酸 銨 、0.5 g MgSO4·7H2O、0.25 g MnSO4·4H2O、1 mL 吐溫 80、20 g瓊脂，補水至 1 L，121℃滅菌15min。

篩選菌株主要發(fā)酵特征檢測培養(yǎng)基按照文獻[10-11]配制：

蛋白酶活性檢測培養(yǎng)基：10g脫脂奶粉，100 mL蒸餾水，4mL濃度為25g/L的石蕊，分裝試管，高度為 4～5cm，113℃滅菌15min。

脂肪酶活性檢測培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基中加入15%的豬油和中性紅指示劑，121℃滅菌20min。

精氨酸產(chǎn)NH3培養(yǎng)基：10g蛋白胨、20g精氨酸、5 g酵母浸粉、0.5 g葡萄糖、5 g乙酸鈉、2 g K2HPO4、2 g 檸檬酸鈉、0.5 g MgSO4·7H2O、0.25 g MnSO4·4H2O、1mL吐溫80、20g瓊脂，補水至1L，121℃滅菌15min。

產(chǎn)生物胺檢測培養(yǎng)基：5 g蛋白胨，3 g酵母膏，1 g葡萄糖，1 mL濃度為1.6%的溴甲酚紫-乙醇溶液，1L蒸餾水，加熱溶解，加入5gL-氨基酸或者10g DL-氨基酸，調(diào)pH至6.8。對照培養(yǎng)基不加氨基酸。分裝小試管，上面滴加一層液體石蠟，115℃滅菌10min。

產(chǎn)H2S培養(yǎng)基（醋酸鉛紙條法）：10 g蛋白胨，10g牛肉膏，5g氯化鈉，0.5g半胱氨酸，1L蒸餾水，調(diào) pH至7.0～7.4，112℃滅菌 20min。

葡萄糖產(chǎn)CO2培養(yǎng)基：10g蛋白胨，5 g氯化鈉，1L蒸餾水，加熱溶解，待冷卻后將pH調(diào)至7.4。加入1～2 mL濃度為1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液，再加入葡萄糖使葡萄糖終濃度為20%，分裝試管，將杜氏小管倒置放入試管中，121℃滅菌30min。

耐鹽試驗培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入NaCl，使得NaCl的終濃度為6%。

耐亞硝酸鹽試驗培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加入NaNO2，使得NaNO2的終濃度為150mg/L。

1.2 主要儀器與設(shè)備

S 1000 PCR儀，Wide Mini-Sub Cell GT型水平電泳槽，PowerPac Basic型電泳儀電源，Universal Hood II型凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-rad公司；Micro 21 R型高速冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；AFZ-1002-U型超純水儀，美國Aquapro公司；UV-2450紫外分光光度計，日本Shimadzu公司。

1.3 乳酸菌的分離與鑒定

在無菌條件下，稱取5 g樣品，剪碎，放入裝有50 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，室溫震蕩30 min。靜置數(shù)分鐘，取1 mL上清液依次進行10倍梯度稀釋涂布，37℃培養(yǎng)48h。根據(jù)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和初步鏡檢觀察，挑選不同的特征菌落，經(jīng)多次劃線分離純化。純化之后的菌株增殖培養(yǎng)之后，提取菌株DNA，并進行擴增，測序。測序結(jié)果輸入到NCBI數(shù)據(jù)庫中進行序列比對。

1.4 篩選菌株在不同溫度下生長情況的檢測

將篩選菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，分別于5，10，15，20，25，30℃下培養(yǎng) 24h，測定 600nm 處OD值。

1.5 篩選菌株主要發(fā)酵特征的檢測

將篩選菌株接種到相應(yīng)的發(fā)酵特征檢測培養(yǎng)基，培養(yǎng)檢測。

1.6 篩選菌株的培養(yǎng)及無細胞提取液的制備

篩選菌株采用MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24h，所有的菌株經(jīng)過3次傳代。培養(yǎng)液離心（10000g，10min，4℃），收集菌體。0.02mol/L磷酸鈉緩沖液洗滌菌體3次，菌體重懸于滅菌的0.02 mol/L磷酸鈉緩沖液，菌體濃度調(diào)至107CFU/mL，得到細胞懸浮液。冰浴超聲破碎細胞懸浮液，離心（10000g，10min，4℃），收集上清液，即為無細胞提取液。

1.7 篩選菌株清除羥自由基和DPPH自由基能力的測定

篩選菌株對羥自由基的清除能力的測定方法參照文獻[11]。依次取1mL鄰二氮菲（0.75mmol/L），2mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 7.4）和 1 mL樣品（細胞懸浮液或者無細胞提取液）混勻。再加入1mL H2O2（0.01%），37℃水浴反應(yīng) 90min。 加入細胞懸浮液的一組，離心，取上清液。分別測定上清液在536nm處的吸收值。

式中：AS——樣品的吸收值；

A0——沒加樣品的對照組的吸收值；

A——沒加樣品和H2O2的空白吸收值。

篩選菌株對DPPH自由基清除能力的測定方法參照He[12]與Wang[9]的方法稍加改進。取1mL樣品（細胞懸浮液或者無細胞提取液）和2 mL DPPH（0.2mmol/L，溶于95%乙醇），混勻。室溫暗反應(yīng)30min。加入細胞懸浮液的一組，離心，取上清液。分別測定上清液在517nm處的吸收值。

式中：AS——實驗組的吸收值；

AB——加入95%乙醇和樣品的空白吸收值；AC——加磷酸鹽緩沖溶液和DPPH溶液的對照組的吸收值。

1.8 篩選菌株還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力的測定

篩選菌株還原能力的測定參考文獻[13]的方法，并略有改進。依次取0.5mL樣品（細胞懸浮液或者無細胞提取液），0.5mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol/L，pH 6.6）和 0.5 mL 鐵氰化鉀溶液（1%），混勻，50℃水浴反應(yīng)20min。加入0.5mL三氯乙酸溶液（10%），離心（3 000g，5min），取 500μL 上清液和 200 μL 三氯化鐵溶液混勻，靜置10min。測定在700nm處的吸收值。吸收值越大，還原活性就越大。

菌株抗脂質(zhì)過氧化能力的測定參照Lee等[14]的方法。取0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液 （0.02 mol/L，pH 7.4），1 mL 亞油酸乳化液，0.2 mL FeSO4溶液（0.01%），0.02 mL抗壞血酸（0.01%）和 0.4 mL樣品（細胞懸浮液或者無細胞提取液）混勻，37℃反應(yīng)12h。吸取1mL反應(yīng)液，0.1mL三氯乙酸溶液（4%），1 mL硫代巴比妥酸溶液（0.8%）和0.1 mL 2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚溶液（0.4%）混勻。100℃下反應(yīng)30min，冷卻。加入1mL正丁醇抽提，離心（1800g，10min）吸取上清液，測532nm處吸收值（AS）。 以磷酸鹽緩沖液代替樣品為對照（AB）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

從四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中共分離純化出乳酸菌逾100株，通過比較菌落形態(tài)及鏡檢觀察，共挑選40株乳酸菌進行分子鑒定，鑒定結(jié)果如表1所示。各菌株與NCBI BLAST數(shù)據(jù)庫檢索得到的最相似模式菌株同源性均大于或等于99%。初步鑒定出有7種不同的乳酸菌。所占比例最多的是Weissella hellenica，其次是Leuconostoc mesenteroides。分離到的乳酸菌，在已有的研究報道中，除W.confusa被報道為致病菌外[15]，其余均在肉類發(fā)酵劑使用，因此舍去W.confusa，然后挑選出初步判斷為不一樣的8株菌株進行進一步研究。對這8株菌進行編號為L1：W.hellenica strain；L2：L.plantarum； L3：W.hellenica；L4：L.mesenteroides； L5：L.curvatus；L6：L.plantarum；L7：W.cibaria；L8：W.viridescens。

2.2 篩選菌株的主要發(fā)酵特征

用作肉類發(fā)酵劑的菌株需要滿足肉類發(fā)酵劑的要求，即具有蛋白酶和脂肪酶活性，不產(chǎn)NH3、不產(chǎn)生物胺、不產(chǎn)H2S、不產(chǎn)CO2、能夠耐受6%NaCl和150mg/kg NaNO2等[9]。篩選菌株的主要發(fā)酵特征見表 2，篩選菌株中 L2、L3、L4、L5、L6、L8 具有分解蛋白的能力。所有篩選菌株均不具有分解脂質(zhì)、產(chǎn)NH3、產(chǎn)生物胺、產(chǎn)H2S和產(chǎn)CO2的能力。所有篩選菌株均能夠耐受6%NaCl和150mg/kg NaNO2，其中L6對NaCl的耐受性最差，耐受性僅為23.22%，L7和L8對NaNO2的耐受性相對較差，NaNO2耐受性分別為72.29%和72.55%。

表1 從四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中分離的乳酸菌的種類及所占比例

2.3 篩選菌株在不同溫度下生長情況

制備發(fā)酵肉制品原料時的溫度范圍為4～7℃，發(fā)酵過程的溫度范圍為18～24℃，干燥成熟過程的溫度范圍為12～15℃。用作肉類發(fā)酵劑的菌株要求能夠在5～30℃存活或生長[6]。篩選菌株在不同溫度的生長情況如圖1所示，篩選到的菌株在5℃都幾乎不生長，L1和L7適應(yīng)的溫度范圍較窄，在5～20℃都不生長，而篩選到的其他菌株適應(yīng)的溫度范圍較寬，在15～30℃均能生長，在30℃生長最好，其中L2和L4在低溫下生長能力較強，這與肉類發(fā)酵劑的要求相符。因此舍去L1和L7，對其余篩選菌株進一步研究。

圖1 篩選菌株在不同溫度下生長情況

表2 篩選菌株的主要發(fā)酵特征1）-2）

2.4 篩選菌株清除羥自由基和DPPH自由基能力

檢測對DPPH自由基和羥自由基的清除能力是評價抗氧化能力的常用有效方法。為了初步判斷具有抗氧化能力的物質(zhì)在胞內(nèi)還是胞外，同時檢測了細胞懸浮液和無細胞提取液的清除能力。由圖2可以看出，所有篩選菌株的無細胞提取液和細胞懸浮液均具有清除DPPH自由基和羥自由基的能力，L6的細胞懸浮液清除能力最強，清除率分別至24.16%和52.48%。所有篩選菌株的細胞懸浮液對DPPH自由基的清除能力均強于其無細胞提取液的清除能力。L2、L3、L8的無細胞提取液和細胞懸浮液對羥自由基的清除率均高于20%。雖然用于實驗的菌體濃度（107cells/mL）比文獻[16]的菌體濃度（1010cells/mL）低，但對自由基的清除率卻高于其實驗結(jié)果。已有研究表明，細胞懸浮液具有的抗氧化能力與菌體表面的蛋白和多糖有關(guān)[6]，無細胞提取液具有的抗氧化能力與細胞內(nèi)的抗氧化酶有關(guān)，例如谷胱甘肽過氧化物酶，過氧化氫酶，超氧化物歧化酶等[17]。

圖2 篩選菌株DPPH自由基和羥自由基清除能力

2.5 篩選菌株還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力

圖3 篩選菌株還原能力

圖4 篩選菌株抑制脂質(zhì)過氧化能力

對還原能力和抗脂質(zhì)過氧化能力的檢測同樣是評價抗氧化能力的常用指標之一。已有研究報道中將在700nm處的吸收值達到0.040視為具有較高的還原能力[4]，圖3表明篩選的菌株均具有較高還原能力，尤其是L5和L6。細胞懸浮液具有還原能力與細胞表面的多糖和蛋白有關(guān)，而無細胞提取液具有還原能力與細胞內(nèi)的抗氧化物質(zhì)有關(guān)，如NADH、NADPH、谷胱甘肽、尿酸等[18]。圖4表明，除L6的無細胞提取液和L8的細胞懸浮液不具有抗脂質(zhì)過氧化能力，其余篩選菌株的無細胞提取液和細胞懸浮液菌體均具有抗脂質(zhì)過氧化能力，抗脂質(zhì)過氧化率均高于20%，L5抗脂質(zhì)過氧化率最高，至63.36%。篩選菌株具有抗脂質(zhì)過氧化能力可能是因為它們能夠清除超氧陰離子[19]。

3 結(jié)束語

本研究從四川傳統(tǒng)腌臘肉制品中篩選出8株乳酸菌，綜合來看，篩選菌株中L4，即L.mesenteroides，不僅主要發(fā)酵特征滿足肉類發(fā)酵劑的要求，對NaCl和NaNO2耐受性較強，適應(yīng)的溫度范圍寬，在低溫下生長能力較強，還具有較強的抗氧化能力。結(jié)合L4在篩選菌株中所占比例較大這一實驗結(jié)果，猜測L4對四川傳統(tǒng)腌臘肉制品的品質(zhì)具有重要貢獻。因此從四川農(nóng)家自制傳統(tǒng)腌臘肉制品篩選出的具有抗氧化能力的L.mesenteroides值得進一步研究，有望開發(fā)成具有抗氧化能力的肉類發(fā)酵劑，用于發(fā)酵肉制品生產(chǎn)，減緩產(chǎn)品氧化、保證產(chǎn)品質(zhì)量和延長產(chǎn)品貨架期。

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