宏基因組技術(shù)在氮循環(huán)功能微生物分子檢測(cè)研究中的應(yīng)用

王朱珺 王尚 劉洋熒 馮凱 鄧曄

（1. 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心中國(guó)科學(xué)院環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085；2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

氮循環(huán)是生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成部分，現(xiàn)代氮循環(huán)幾乎全部依靠微生物介導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)完成（圖1），只有小部分依靠長(zhǎng)期的地質(zhì)循環(huán)［1-2］。微生物，包括細(xì)菌、古菌和真菌，在氮循環(huán)中起著不可替代的作用，它們之所以能夠?qū)崿F(xiàn)氮素轉(zhuǎn)化是由于體內(nèi)存在一系列氮代謝相關(guān)的酶。編碼這些酶的活性亞基的基因可作為相應(yīng)微生物的功能標(biāo)記基因［3］，通過(guò)分子檢測(cè)技術(shù)鑒定這些功能基因是我們了解環(huán)境中氮循環(huán)過(guò)程的重要手段和方法。

圖1 氮循環(huán)的各個(gè)生態(tài)過(guò)程及相關(guān)的功能基因

對(duì)參與氮循環(huán)的功能微生物的研究已有上百年歷史，編碼特定功能酶的功能基因不斷成功破譯，極大地拓展了對(duì)氮循環(huán)功能微生物的認(rèn)識(shí)。尤其是近十幾年來(lái)宏基因組學(xué)技術(shù)的革新，促使氮循環(huán)相關(guān)研究出現(xiàn)了一系列令人矚目的成果，例如氨氧化古菌和完全硝化菌的發(fā)現(xiàn)更是顛覆了人們百年來(lái)對(duì)硝化作用的固有認(rèn)識(shí)。早在19世紀(jì)，Winogradsky（1890年）分離的一株氨氧化菌便證明了細(xì)菌在硝化作用中發(fā)揮著作用，由此氨氧化細(xì)菌（AOB）被認(rèn)為是氨氧化過(guò)程的主要參與者。直到2004年基于宏基因組學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，海洋古菌的基因組中含有與細(xì)菌類似的編碼氨單加氧酶的結(jié)構(gòu)基因［4］；而次年從西雅圖水族館海水中分離培養(yǎng)得到第一株氨氧化古菌（AOA）［5］，至此徹底改變了學(xué)術(shù)界認(rèn)為只有AOB進(jìn)行氨氧化作用的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)［6-7］。而2015年完全硝化菌成為了又一顛覆性發(fā)現(xiàn)，Daims等［8］和van Kessel等［9］對(duì)全球廣泛分布的硝化螺旋菌屬（Nitrospira）進(jìn)行宏基因組高通量測(cè)序，發(fā)現(xiàn)這種化能自養(yǎng)菌擁有能夠編碼完成硝化作用將NH4+轉(zhuǎn)化為NO2-再轉(zhuǎn)化為NO3-的兩大步驟必需的所有酶，比常規(guī)的氨氧化微生物生長(zhǎng)率更低而生長(zhǎng)量更高。他們這一重大發(fā)現(xiàn)顛覆了一直以來(lái)認(rèn)為硝化作用的兩大步驟不能被同一個(gè)微生物催化完成的固有觀念，完全硝化菌也因此成為了氮循環(huán)微生物的重要成員。在回顧氮循環(huán)研究發(fā)展的歷程中，我們發(fā)現(xiàn)在各個(gè)重要節(jié)點(diǎn)，功能基因分子檢測(cè)技術(shù)都起到了關(guān)鍵性作用。本文將簡(jiǎn)要介紹PCR擴(kuò)增技術(shù)、DNA指紋圖譜技術(shù)、穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)、分子雜交技術(shù)、測(cè)序技術(shù)等分子檢測(cè)技術(shù)，重點(diǎn)論述其在氮循環(huán)功能微生物的群落多樣性方面的研究進(jìn)展，最后指出分子檢測(cè)技術(shù)的革新和完善的數(shù)據(jù)分析平臺(tái)的建立對(duì)未來(lái)氮循環(huán)功能微生物研究的重要意義。

1 分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展

準(zhǔn)確測(cè)量微生物豐度是開(kāi)展微生物生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)，但精確度量是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)的任務(wù)，而分子技術(shù)的革新使得更為精準(zhǔn)的度量成為可能［10］。宏基因組分子檢測(cè)技術(shù)使用非培養(yǎng)的手段，通過(guò)環(huán)境樣品中所有微生物的DNA來(lái)獲得微生物群落遺傳信息，能夠更加全面、真實(shí)、精確地反映微生物群落的結(jié)構(gòu)及潛在功能［11-12］。常用的分子檢測(cè)技術(shù)分為五大類：PCR擴(kuò)增技術(shù)、DNA指紋圖譜技術(shù)、穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)、分子雜交技術(shù)、測(cè)序技術(shù)（表1）。

常用的分子檢測(cè)技術(shù)中，基因芯片和高通量測(cè)序技術(shù)屬于高通量分子檢測(cè)技術(shù)，其他的技術(shù)通量較低?；蛐酒夹g(shù)通過(guò)一組已知核酸探針與環(huán)境樣品雜交進(jìn)行核酸序列測(cè)定［11］?；蛐酒ㄏ到y(tǒng)發(fā)育芯片（PhyloChip）和功能基因芯片（GeoChip）［20］，系統(tǒng)發(fā)育芯片通過(guò)檢測(cè)特異性的16S rRNA等系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因，反映不同物種在特定環(huán)境的分布情況；功能基因芯片通過(guò)檢測(cè)執(zhí)行特殊功能的功能基因，來(lái)反映在微生物群落中的功能類群的分布情況。高通量測(cè)序技術(shù)分為擴(kuò)增子測(cè)序和宏基因組鳥槍測(cè)序。擴(kuò)增子測(cè)序是針對(duì)目標(biāo)基因，如16S rRNA基因展開(kāi)測(cè)序，包括焦磷酸測(cè)序，Miseq和Hiseq等；鳥槍測(cè)序不針對(duì)特定目標(biāo)基因，隨機(jī)地對(duì)環(huán)境樣品基因組展開(kāi)測(cè)序［11］。

表1 常用分子檢測(cè)技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比

此外，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)首先利用單細(xì)胞分離技術(shù)將細(xì)胞分離成個(gè)體，然后針對(duì)單個(gè)細(xì)胞的基因組進(jìn)行高通量測(cè)序分析，能夠揭示單個(gè)細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)狀態(tài)，獲取未培養(yǎng)微生物遺傳信息，在發(fā)掘環(huán)境“暗物質(zhì)”方面有很好的應(yīng)用前景［18-19］。細(xì)胞內(nèi)融合 PCR 技術(shù)（Emulsion paired isolation and concatenation PCR，epicPCR）［21］是2016年發(fā)表的技術(shù)，該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是可在未培養(yǎng)的單細(xì)胞中將功能基因與系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記基因（如16S rRNA基因）連接在一起，通量可達(dá)數(shù)十萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，而成本只與一個(gè)基因組文庫(kù)相當(dāng)。

自1991年克隆文庫(kù)［22］應(yīng)用于環(huán)境樣本研究開(kāi)始，F(xiàn)ISH［23］、DGGE［24］、T-RFLP［25］、DNASIP［26］、qPCR［27］、基因芯片［28］、高通量測(cè)序［29-30］、單細(xì)胞測(cè)序［31-32］、epicPCR［21］這些分子檢測(cè)技術(shù)也相繼應(yīng)用于環(huán)境樣本研究（圖2-A）。最早應(yīng)用于環(huán)境氮循環(huán)功能微生物研究的分子檢測(cè)技術(shù)是克隆文庫(kù)［33］，始于 1997 年，隨后 FISH［34］、T-RFLP［35］、DGGE［36］、基因芯片［28］、qPCR［37］、DNA-SIP［38］、高通量測(cè)序［39］也相繼應(yīng)用于環(huán)境樣本中氮循環(huán)功能基因的研究（圖2-B）。分子檢測(cè)技術(shù)在幫助研究者有效識(shí)別氮循環(huán)各過(guò)程中的關(guān)鍵微生物類群、揭示不同環(huán)境中氮循環(huán)功能微生物與環(huán)境的互作機(jī)制方面起到了重要作用，為我們更深入地解析不同生態(tài)系統(tǒng)中氮循環(huán)過(guò)程對(duì)全球氣候環(huán)境變化的響應(yīng)與反饋奠定了理論基礎(chǔ)。

2 固氮作用功能基因nifH

固氮作用（Nitrogen fixation）是N2被還原成NH4+和其他含氮化合物的過(guò)程（圖1），微生物在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究表明生物固氮作用貢獻(xiàn)了生物圈中近一半的氮元素年輸入總量［40］，是自然生態(tài)系統(tǒng)和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中重要的氮來(lái)源過(guò)程。固氮酶由nifD和nifK基因編碼的異源四聚體以及nifH基因編碼的二氮酶還原酶亞基兩個(gè)組分構(gòu)成［40］。nifH基因作為固氮作用的標(biāo)記基因［41］，主要基于兩點(diǎn)考慮：一是，目前已知的所有固氮生物都包含nifH基因；二是，基于nifH基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系非常地接近［42］。nifH基因的同系物可分成5個(gè)主要的系統(tǒng)發(fā)育群系［43］，而根據(jù)同源性收集的nifH基因數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm）可用于系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化的相關(guān)分析、探針/引物的設(shè)計(jì)和評(píng)估、以及固氮酶基因多樣性的檢測(cè)［40-42］。

圖2 不同分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境樣本（A）和氮循環(huán)功能基因（B）的發(fā)展史

基于nifH基因的高通量分子檢測(cè)技術(shù)能更深入、全面、細(xì)致地揭示不同土壤生態(tài)系統(tǒng)中固氮微生物的組成、多樣性及功能。在自然土壤固氮微生物的研究中，Soni等［42］使用基于PCR擴(kuò)增的克隆文庫(kù)方法研究了西印度喜馬拉雅山脈土壤中的固氮微生物，結(jié)果表明大多數(shù)固氮微生物屬于γ-變形菌（γ-Proteobacteria），且不同的土壤類型中的固氮菌群落結(jié)構(gòu)不同。Wang等［44］應(yīng)用454焦磷酸測(cè)序法研究騰格里沙漠植被恢復(fù)地區(qū)中100年來(lái)固氮微生物的演化，發(fā)現(xiàn)在植被恢復(fù)區(qū)表層土中進(jìn)行固氮作用的微生物主要屬于藍(lán)藻（Cyanobacteria），藍(lán)藻不僅維持著沙漠表土中的固氮收支平衡，對(duì)沙漠中的初級(jí)生產(chǎn)力也有極大的貢獻(xiàn)。在農(nóng)業(yè)土壤固氮微生物研究中，Wang等［45］使用qPCR和T-RFLP技術(shù)，分析了小麥生長(zhǎng)季節(jié)中在四種不同施肥模式下、不同深度土壤中固氮微生物群落豐度和結(jié)構(gòu)的變化；結(jié)果表明隨著土壤深度的增加nifH基因和16S rRNA基因豐度下降，而土壤深度增加帶來(lái)的土壤理化性質(zhì)的變化是影響固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的主要因子，而非取樣季節(jié)或施肥模式。Zhang等［46］使用ITPGM（Ion Torrent Personal Genome Machine）和454焦磷酸測(cè)序?qū)λ姆N不同作物類型和輪作方式的種植系統(tǒng)土壤樣品中微生物的nifH基因進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在5%氨基酸序列不相似性水平下，總共檢測(cè)到6182個(gè)操作分類單元（Operational taxonomic units, OTU），現(xiàn)有作物類型和輪作歷史是顯著影響固氮微生物群落結(jié)構(gòu)的重要因素。土壤生態(tài)系統(tǒng)的固氮微生物研究發(fā)現(xiàn)，自然土壤生態(tài)系統(tǒng)中固氮菌主要包括γ-變形菌和藍(lán)藻，固氮菌對(duì)土壤植被恢復(fù)有一定的貢獻(xiàn)，農(nóng)業(yè)土壤生態(tài)系統(tǒng)中固氮菌受到土壤深度、作物類型和輪作歷史帶來(lái)的土壤理化性質(zhì)的變化的顯著影響。

在水體環(huán)境中，高通量分子檢測(cè)技術(shù)也有更好的表現(xiàn)。Wang等［47］綜合使用nifH基因克隆文庫(kù)、DGGE法、qPCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR法，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻是中國(guó)東圳水庫(kù)中主要的固氮微生物；水分層/混合狀態(tài)和氮含量會(huì)導(dǎo)致固氮菌群落分布的垂直模式和季節(jié)模式的變化，從而影響水體的氮循環(huán)。Xiao等［48］使用焦磷酸測(cè)序法對(duì)中國(guó)南海從珠江三角洲到開(kāi)闊海域200m以上的表層海水中的固氮菌群進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)固氮菌的多樣性很低，主要由γ-變形菌和束毛藻屬（Trichodesmium）組成，而水深是影響固氮微生物豐度和多樣性的最重要的因素。綜合土壤環(huán)境和水體環(huán)境中固氮菌的研究發(fā)現(xiàn)，γ-變形菌和藍(lán)藻確實(shí)是占主導(dǎo)的固氮微生物。在水體環(huán)境中，水深是影響固氮菌垂直分布的主要原因。

454焦磷酸測(cè)序、qPCR、克隆文庫(kù)等方法能較為全面地檢測(cè)nifH基因在土壤環(huán)境和水體環(huán)境中的分布。其中，454焦磷酸測(cè)序法和qPCR的到的數(shù)據(jù)更為細(xì)致。但每一種技術(shù)都有其局限性（表1），新的技術(shù)在解決之前技術(shù)局限性的同時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生新的問(wèn)題。在有完善的數(shù)據(jù)庫(kù)的前提下，使用更新的高通量分子檢測(cè)技術(shù)能更深入、全面、細(xì)致地揭示不同生態(tài)系統(tǒng)中固氮微生物的組成、多樣性及功能。

3 硝化作用功能基因

硝化作用（Nitrification）廣泛存在于各種生態(tài)系統(tǒng)中，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)以及廢物處理都起著極為重要的作用［6］。該過(guò)程包含3個(gè)小步驟，NH4+氧化為NH2OH，進(jìn)而被氧化為，最后NO2-被氧化為NO3-（圖1），對(duì)應(yīng)的功能基因分別是 a moA、hao［49］和 n xrA 基因［50］。原來(lái)認(rèn)為氨氧化過(guò)程和亞硝酸鹽氧化過(guò)程是由不同的微生物完成，而最新發(fā)現(xiàn)的完全硝化菌可以獨(dú)自完成這兩個(gè)過(guò)程［8-9］。

3.1 氨單加氧酶基因amoA

氨單加氧酶（Amo）催化NH4+氧化為NH2OH，是氨氧化作用中重要的酶［51］，Amo操縱子由amoA、amoB和amoC這3個(gè)結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成，amoA基因編碼Amo的活性蛋白亞基，且具有一定的序列保守性［49］。已經(jīng)證實(shí)amoA基因和16S rRNA在系統(tǒng)發(fā)育上是一致的，且存在于所有氨氧化微生物中［52］，因此被選作Amo酶的功能標(biāo)記基因，常用于氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）的檢測(cè)分析。通過(guò)amoA基因的分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AOA和AOB廣泛分布于土壤、污水處理系統(tǒng)和海洋環(huán)境中。

在農(nóng)業(yè)土壤系統(tǒng)中，Cubillos等［53］使用基于16S rRNA和amoA基因的DGGE法研究了哥倫比亞不同畜牧系統(tǒng)對(duì)AOB群落的影響，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)單一牧場(chǎng)（Conventional monoculture pastures）中的AOB的豐度以及硝化潛力顯著高于其他兩個(gè)系統(tǒng)，多冠層密集型森林畜牧系統(tǒng)（Multi-canopy intensive silvopastoral systems，ISS）中的豐度相對(duì)較低，與當(dāng)?shù)厣值貐^(qū)豐度相當(dāng)；ISS中的草本、灌木、喬木已被開(kāi)發(fā)為當(dāng)?shù)厣蟮娘暳蟻?lái)源，可減少外部投入的需求，以達(dá)到保護(hù)景觀和改善土壤質(zhì)量的目的，對(duì)ISS進(jìn)行3-15年的年序研究發(fā)現(xiàn)，年序越大的ISS的細(xì)菌群落越趨于相似。Yang等［54］使用基于amoA基因的Illumina Miseq高通量測(cè)序檢測(cè)中國(guó)北部小麥-玉米輪作土壤中施肥種類和灌溉頻率對(duì)AOA和AOB的影響，結(jié)果表明AOA群落主要受到灌溉頻率的影響，而AOB對(duì)于施肥種類有更強(qiáng)地響應(yīng)；另外，土壤濕度、pH對(duì)AOA有顯著影響，總有機(jī)碳對(duì)AOB影響顯著，而土壤總氮含量對(duì)AOA和AOB均有顯著影響。受農(nóng)業(yè)影響越大的土壤（特別是施肥的影響）中AOB的豐度和硝化潛力越大，越接近于自然生態(tài)系統(tǒng)的農(nóng)業(yè)土壤中的AOB越接近于普通水平。AOA和AOB對(duì)農(nóng)業(yè)措施的響應(yīng)是不一樣的，AOA群落受到灌溉頻率的影響更大。

在廢水處理系統(tǒng)中，Gao等［55］運(yùn)用基于amoA基因的qPCR檢測(cè)生活污水、工業(yè)污水和實(shí)驗(yàn)室污水處理共10個(gè)污水處理系統(tǒng)中AOA和AOB的豐度，發(fā)現(xiàn)AOB比AOA豐度更高、分布更廣泛，說(shuō)明在污水處理系統(tǒng)中AOB可能比AOA發(fā)揮更重要的作用。Zhang等［56］運(yùn)用基于amoA基因和16S rRNA基因的GeoChip、454焦磷酸測(cè)序和qPCR分子檢測(cè)技術(shù)，分析了螺旋霉素或者氧四環(huán)素廢水處理系統(tǒng)中AOA和AOB的群落變化，結(jié)果表明在含有螺旋霉素的廢水處理系統(tǒng)中AOA豐度顯著高于AOB，而氧四環(huán)素系統(tǒng)中AOA豐度低于AOB，無(wú)抗生素的對(duì)照系統(tǒng)中沒(méi)有檢測(cè)到AOA；螺旋霉素系統(tǒng)中AOA的78.5%-99.6%屬于奇古菌門（Thaumarchaeota）；GeoChip結(jié)果顯示AOA的amoA基因信號(hào)強(qiáng)度與螺旋霉素的濃度相關(guān)（P＜0.05），AOA在高濃度的螺旋霉素壓力下比AOB更能占據(jù)優(yōu)勢(shì)。在不同的廢水處理系統(tǒng)中，AOA和AOB的分布和豐度是不一樣的，在生活污水、工業(yè)污水、實(shí)驗(yàn)室污水和氧四環(huán)素污水中AOB比AOA豐度更高，而在高濃度的螺旋霉素壓力下AOA比AOB更能占據(jù)優(yōu)勢(shì)。

在海洋環(huán)境中，影響氨氧化微生物群落組成和分布的主要環(huán)境因素有溫度、鹽度、深度、水溶氧含量和碳氮含量等。Vetterli等［57］運(yùn)用基于amoA基因的T-RFLP法分析發(fā)現(xiàn)，芬蘭海灣富營(yíng)養(yǎng)化沉積物中氨氧化微生物的豐度很高，其中AOA群落分布格局具有強(qiáng)烈的空間變化，而AOB群落分布則具有顯著的時(shí)間變化特點(diǎn)，而在開(kāi)放海域，AOA和 AOB豐度很低，以芬蘭海灣特有的物種為主；影響氨氧化微生物時(shí)空分布模式的主要環(huán)境因素有鹽度、碳氮含量以及水溶氧含量。Bertagnolli等［58］運(yùn)用基于amoA基因的Illumina Miseq高通量測(cè)序檢測(cè)智利海岸海水中奇古菌的豐度，智利海岸海水是季節(jié)性低氧或缺氧的，其溫度、鹽度和深度是對(duì)奇古菌群落組成影響最大的因素；奇古菌門的Nitrosopumilus-A在所有樣本中均有分布（42%-100% OTU），而Nitrosopumilus-B主要分布在春夏季節(jié)含氧量下降的深層海水中。在海洋環(huán)境中AOA和AOB的分布格局不同，AOA受空間分布影響，而AOB受時(shí)間分布影響，溫度、鹽度、深度等環(huán)境因素都是影響海洋氨氧化微生物的重要因子，而影響不同遺傳譜系的AOA的環(huán)境因子也不同。

不管在土壤、廢水還是海洋系統(tǒng)中，AOA和AOB的表現(xiàn)都會(huì)呈現(xiàn)出明顯的差異，對(duì)兩者產(chǎn)生影響的環(huán)境因子也不同。目前很多研究中都會(huì)使用不同的技術(shù)手段對(duì)這兩者進(jìn)行分別研究，但無(wú)疑更新的、更細(xì)致的技術(shù)能夠更好地檢測(cè)出這兩者之間存在的更細(xì)微的差別，目前檢測(cè)兩者表現(xiàn)差異使用比較多的技術(shù)是Illumina Miseq高通量測(cè)序、GeoChip和 qPCR［54，56，58］。

3.2 羥胺氧化還原酶基因hao和亞硝酸鹽氧化還原酶基因nxrA

羥胺氧化還原酶（Hao）催化NH2OH氧化為，hao基因是對(duì)應(yīng)的功能標(biāo)記基因［49］。對(duì)hao基因的研究目前主要集中于分離純菌株及對(duì)功能蛋白和基因結(jié)構(gòu)的研究［49，59-61］，對(duì)其在環(huán)境樣本中的研究則鮮有報(bào)道。陳春蘭等［49］以一個(gè)水稻長(zhǎng)期定位試驗(yàn)田為平臺(tái)，構(gòu)建hao基因和amoA基因克隆文庫(kù)，研究長(zhǎng)期施氮肥對(duì)亞硝化菌和氨氧化菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，施氮肥使氨氧化微生物和亞硝化菌多樣性降低，群落結(jié)構(gòu)趨于單一。

亞硝酸鹽氧化還原酶（Nxr）催化NO2-氧化為。Nxr酶是由一個(gè)α亞基和一個(gè)β亞基組成的異源二聚體，nxrA基因編碼Nxr酶催化亞基α亞基，是 Nxr酶的功能標(biāo)記基因［50］。Rani等［62］將 nxrA基因作為功能標(biāo)記基因進(jìn)行擴(kuò)增子焦磷酸測(cè)序，發(fā)現(xiàn)全球六個(gè)不同地域的海洋沉積物中的硝化刺菌屬（Nitrospina）細(xì)菌數(shù)量分布出乎意料的少，且極地區(qū)域的多樣性低于非極地區(qū)域。

在以上報(bào)道中，檢測(cè)到的硝化作用相關(guān)功能基因主要分布在在農(nóng)業(yè)系統(tǒng)土壤、廢水系統(tǒng)和海洋環(huán)境中。amoA基因是硝化作用中最受關(guān)注的基因，研究amoA基因使用的檢測(cè)技術(shù)非常多樣，從Illumina Miseq高通量測(cè)序、GeoChip功能基因芯片、qPCR到DGGE、T-RFLP、克隆文庫(kù)均有涉及。GeoChip功能基因芯片、qPCR均可定量，但qPCR通量偏低；Illumina Miseq高通量測(cè)序、GeoChip功能基因芯片通量高，但GeoChip功能基因芯片只能檢測(cè)已知基因序列，Illumina Miseq高通量測(cè)序有讀長(zhǎng)限制以及取樣、測(cè)序時(shí)隨機(jī)因素和PCR擴(kuò)增的影響［11］。

4 反硝化作用功能基因

反硝化作用（Denitrification）從NO3-到N2包 括四個(gè) 過(guò) 程（圖1）：NO3-→NO2-、NO2-→NO、NO→N2O和N2O→N2，這些反應(yīng)過(guò)程對(duì)應(yīng)的功能標(biāo)記基因分別是narG基因、nirK和nirS基因、norB基因以及nosZ基因。一直以來(lái)人們都認(rèn)為反硝化作用只由細(xì)菌完成，然而近年來(lái)有研究表明真菌和古菌也能進(jìn)行反硝化活動(dòng)［63］。

4.1 硝酸鹽還原酶基因narG

催化NO3-還原化為的硝酸鹽還原酶（Nar）由兩個(gè)在胞質(zhì)中的亞基NarGH、一個(gè)膜結(jié)合亞基NarI以及NarDJ組成，narG基因編碼Nar酶的活性亞基NarG亞基，是Nar酶的功能標(biāo)記基因［64-65］。

目前，以narG基因作為標(biāo)記基因檢測(cè)環(huán)境樣本中的反硝化菌的研究相對(duì)而言并不特別多。Philippot等［66］構(gòu)建narG基因克隆文庫(kù)，對(duì)玉米的不同培養(yǎng)變種根際反硝化菌群落進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素比玉米變種類型對(duì)反硝化菌的群落的影響更大。Deiglmayr等［67］運(yùn)用基于narG基因的PCR-RFLP法分析發(fā)現(xiàn)，NO3-濃度變化對(duì)硝酸鹽還原菌群落功能穩(wěn)定性的影響不顯著，是因?yàn)镹ar酶對(duì)草地土壤中濃度變化有很高的適應(yīng)性。Bulc等［68］使用qPCR法研究了人工溝渠中narG基因的分布，發(fā)現(xiàn)無(wú)論溝渠中廢水的含氧量和含氮量如何，高度波動(dòng)的排水模式是影響整個(gè)廢水系統(tǒng)中narG基因豐度和分布的主要原因。以上結(jié)果表明，在農(nóng)業(yè)土壤和廢水溝渠中NO3-濃度和含氮量都不是影響narG基因豐度和分布的主要原因。

4.2 亞硝酸還原酶基因nirK和nirS

亞硝酸鹽還原酶（Nir）催化NO2-還原化為NO。Nir酶復(fù)合體中，nirK基因編碼依賴銅離子的亞基NirK，而nirS基因編碼含有細(xì)胞色素cd-1的亞基 NirS［65，69，70］。在水體環(huán)境中 nirS 基因的豐度和多樣性顯著高于nirK，但通過(guò)這兩個(gè)基因得到的群落結(jié)構(gòu)均存在季節(jié)性變化。Lee等［71］使用基于nirS和nirK基因的qPCR法研究反硝化菌在舊金山海灣河口沉積物中的分布，發(fā)現(xiàn)在河口區(qū)域nirS基因的豐度和多樣性均顯著高于nirK；兩個(gè)基因存在相似的空間變化規(guī)律，而時(shí)間變化規(guī)律有差異；當(dāng)硝酸鹽濃度高時(shí)nirS豐度高，而溫度低時(shí)nirK豐度高。Zhou等［72］使用基于nirS和nirK基因的Illumina Miseq高通量測(cè)序研究中國(guó)北部一個(gè)淺層富營(yíng)養(yǎng)化的水庫(kù)中反硝化菌群落結(jié)構(gòu)的變化，NirS型反硝化菌的豐度和多樣性高于NirK型反硝化菌；沉積物總氮和溫度是影響反硝化菌群落結(jié)構(gòu)季節(jié)性變化的重要環(huán)境因子。

4.3 一氧化氮還原酶基因norB

一氧化氮還原酶（Nor）將NO還原為N2O，norB基因編碼Nor酶復(fù)合體NorBCDEFQZ中的NorB亞基，是 Nor酶的功能標(biāo)記基因［65］。Fagerstone等［73］通過(guò)norB基因的PCR檢測(cè)確認(rèn)反硝化菌的存在，且發(fā)現(xiàn)抗生素處理反硝化細(xì)菌可以大大減少微藻養(yǎng)殖中N2O的排放量。Kearns等［74］構(gòu)建norB基因和nosZ基因的克隆文庫(kù)，同時(shí)使用qPCR法分析發(fā)現(xiàn)施氮肥的鹽沼中含有norB基因和含有nosZ基因的微生物均屬于α-和β-變形菌；當(dāng)?shù)蕽舛确浅８邥r(shí)，nosZ基因豐度顯著降低，norB基因豐度沒(méi)有顯著變化?？股乜梢越档蚽orB基因豐度，但高氮肥濃度對(duì)norB基因沒(méi)有顯著影響。

4.4 氧化亞氮還原酶基因nosZ

氧化亞氮還原酶（Nos）將N2O還原為N2。Nos酶在系統(tǒng)發(fā)育上有兩個(gè)不同的NosZ分枝，一個(gè)分枝含有典型的Z型NosZ蛋白，另一個(gè)含有非典型的NosZ蛋白［75］。編碼典型的Z型NosZ蛋白的nosZ基因存在于能夠完成反硝化作用的細(xì)菌中，是Nos酶的功能標(biāo)記基因；非典型的nosZ基因存在于能夠完成更多樣化的氮代謝途徑的細(xì)菌中，包括那些缺乏 nirS和 nirK基因的細(xì)菌［75-77］。Orellana等［75］結(jié)合宏基因組鳥槍測(cè)序法和基于nosZ基因的Illumina測(cè)序，分析了美國(guó)中西部玉米主要產(chǎn)區(qū)代表性的砂質(zhì)和泥質(zhì)土壤中nosZ基因的豐度和多樣性，發(fā)現(xiàn)非典型的nosZ基因數(shù)量超過(guò)典型的nosZ基因，突出了非典型nosZ基因微生物在土壤中和在其他環(huán)境中消耗N2O的潛在作用。

貝利尼（Giovanni Bellini）（約 1430～1516年）的一組小型嵌板系列油畫《四寓意》（Four Allegories）（約 1490～1503 年），其中一幅便以“機(jī)運(yùn)”（Fortune）（圖 1）為主題，畫中女子坐在一艘船上，神色憂郁地扶著一個(gè)球體，身旁幾個(gè)天童（Puttoes）的動(dòng)作表情，有的表現(xiàn)出驚慌和擔(dān)憂，也有的焦急和絕望。

水體環(huán)境中溶解氧濃度是影響反硝化菌的重要因素。Wyman等［78］利用qPCR方法分析了阿拉伯海富氧和弱氧的海水中進(jìn)行反硝化作用的α-變形菌的nosZ基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)寬闊富氧的海洋表面比弱氧的海水中的反硝化菌豐度高，富氧的海洋表面可能是N2O的潛在匯。

反硝化作用可以將環(huán)境的硝態(tài)氮肥轉(zhuǎn)化為N2O和N2釋放到大氣中，與農(nóng)業(yè)系統(tǒng)息息相關(guān)。在以上研究中，對(duì)反硝化作用相關(guān)功能基因使用最多的分子檢測(cè)技術(shù)是qPCR。qPCR有很好的定量性，可以定量不同環(huán)境中反硝化作用功能基因的分布，但其通量低、非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增偏差也是很明顯的局限性（表1）。

5 厭氧氨氧化作用功能基因

厭氧氨氧化作用（Anammox）將NH4+氧化為N（2圖1）。厭氧氨氧化作用的分子機(jī)制雖然一直未知，但Kartal等［79］提出，厭氧氨氧化作用中N2H4是由厭氧底物NH4+和NO2-產(chǎn)生，NO是N2H4的直接前體。hzsA基因和hzo基因均可以提供環(huán)境中厭氧氨氧化細(xì)菌的物種分類信息，甚至可能比16S rRNA基因更勝一籌，經(jīng)常作為厭氧氨氧化細(xì)菌的標(biāo)記基因［80-81］。

N2H4合成酶（Hzs）催化在厭氧條件下與由還原產(chǎn)生的NO反應(yīng)生成N2H4，Hzs酶由hzsA、hzsB、hzsC基因共同編碼，hzsA基因編碼Hzs酶的α亞基，是Hzs酶的功能標(biāo)記基因［82-83］。N2H4氧化還原酶（Hzo）催化N2H4氧化為N2，Hzo酶由hzo 基因編碼［84］。

厭氧氨氧化細(xì)菌分布非常廣泛，在海洋、海岸和江河口的沉積物、紅樹林、海洋冰塊和淡水湖中，甚至是西非、智利和秘魯?shù)妊鯕夂孔钚В∣xygen minimum zones，OMZs）都發(fā)現(xiàn)有厭氧氨氧化細(xì)菌的存在［6］。Russ等［85］運(yùn)用基于hzsA基因的qPCR分析加利福尼亞灣兼有冷烴富集流和熱液噴口地區(qū)的沉積物，發(fā)現(xiàn)所有的厭氧氨氧化菌都與“Candidatus Scalindua”屬相近，但系統(tǒng)發(fā)育上屬于兩個(gè)不同的hzsA基因序列簇，相似性低于76%。Bale等［86］在英格蘭北海南部砂質(zhì)和泥質(zhì)砂巖沉積物中，通過(guò)16S rRNA和hzsA基因的逆轉(zhuǎn)錄qPCR和15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化菌在有機(jī)碳含量高的沉積物中活性更高，并且在夏天比冬天活性和豐度更高。Sun等［81］構(gòu)建16S rRNA基因和hzo基因克隆文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)NH4+與、的比例顯著影響了厭氧氨氧化細(xì)菌在東江河中的垂直分布。Naeher等［84］運(yùn)用基于16S rRNA基因和hzo基因的qPCR分析發(fā)現(xiàn)，厭氧氨氧化菌在整個(gè)法國(guó)塞納河河口中均有分布，且豐度很高。以上研究中檢測(cè)到的厭氧氨氧化菌主要分布在水體環(huán)境中，hzsA基因標(biāo)記的厭氧氨氧化菌在有機(jī)碳含量高的沉積物中活性更高，而不同氮素形態(tài)的比例會(huì)顯著影響hzo基因標(biāo)記的厭氧氨氧化菌。

厭氧氨氧化作用功能基因一般分布在水體環(huán)境中。使用最多的分子檢測(cè)技術(shù)是qPCR，可以對(duì)分布于不同水體環(huán)境中的厭氧氨氧化作用功能基因進(jìn)行定量和檢測(cè)（表1）。

6 氮同化還原作用及異化還原作用功能基因

6.1 硝酸鹽同化還原酶基因nasA、narB和異化還原酶基因napA

硝酸鹽同化還原酶Nas和Nar催化NO3-同化還原為Nas酶大亞基由 nasA 基因編碼，相應(yīng)的功能基因是nasA基因［89］，而硝酸鹽同化還原酶Nar的標(biāo)記基因?yàn)閚arB基因［90］。硝酸鹽異化還原酶（Nap）催化NO3-異化還原為，napA 基因編碼Nap酶復(fù)合體NapAB中的NapA亞基。Feng等［91］運(yùn)用PCR擴(kuò)增napA基因，發(fā)現(xiàn)三個(gè)油井廢水中napA基因的豐度和分布會(huì)隨著有機(jī)碳濃度的變化而變化，才將napA基因作為異化硝酸鹽還原菌的標(biāo)記基因。

海洋環(huán)境中，氮同化還原菌的生物地理分布模式與環(huán)境條件密切相關(guān)。Paerl等［92］在加州灣一個(gè)由沿岸涌升流和貧營(yíng)養(yǎng)太平洋組成的動(dòng)態(tài)區(qū)域（California current system，CCS）中，運(yùn)用qPCR分析發(fā)現(xiàn)在CCS的核心區(qū)域聚球藻的數(shù)量和聚球藻narB基因的豐度較低，而沿岸過(guò)渡地帶較高；該研究組運(yùn)用同樣的方法分析發(fā)現(xiàn)，蒙特利灣每年春季上升的涌流導(dǎo)致聚球藻種群及其narB基因亞群豐度下降，且所檢測(cè)的金屬離子等環(huán)境因子對(duì)narB 基因的豐度沒(méi)有顯著影響［93］。Jiang等［89］建立 16S rRNA和nasA基因克隆文庫(kù)，分析硝酸鹽同化細(xì)菌在幾個(gè)大洋沿岸海域的地理分布和多樣性，發(fā)現(xiàn)鹽濃度、溫度和硝酸鹽濃度是影響氮同化還原菌的分布和多樣性的主要環(huán)境因子。

6.2 亞硝酸鹽同化還原酶基因nirA、nirB和異化還原酶基因nrfA

亞硝酸鹽同化還原酶（Nir）催化NO2-同化還原 為nirA 和 n irB 基 因 分 別 編 碼 N irA 和NirB亞基，這兩種基因可作為Nir酶的功能標(biāo)記基因［95］。在多種藍(lán)藻中已發(fā)現(xiàn)一種nirA操縱子，包含亞硝酸同化還原酶基因nirA、編碼轉(zhuǎn)運(yùn)NO-和NO-32的ABC型轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的nrtABCD基因，和硝酸鹽同化還原酶基因narB，nirA操縱子只有在NO-或NO-32濃度高而NH4+濃度低的時(shí)候才會(huì)高度表達(dá)［95］。nirB基因轉(zhuǎn)錄在nirA操縱子的上游，其編碼的NirB酶在NirA酶成熟過(guò)程中扮演骨架蛋白的角色，NirA酶的表達(dá)需要NirB酶的存在［95-97］。Alcantara-Hernandez等［98］利用narB基因和nirA基因作為功能標(biāo)記基因?qū)δ鞲缫粔K極端鹽堿地（以前是Texcoco湖）進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)含有narB和nirA基因的嗜鹽古菌占主要地位；在pH大于10甚至更高的環(huán)境中NH4+會(huì)轉(zhuǎn)化成NH3，而NO3-和NO2-是更好的氮源，所以嗜鹽古菌對(duì)硝酸鹽的代謝能力對(duì)其生存有重要意義。

甲酸依賴型亞硝酸鹽還原酶（Nrf）催化NO-2異化還原為NH4+。Nrf酶由一個(gè)7個(gè)基因組成的操縱子nrfABCDEFG編碼，nrfA編碼的催化亞基NrfA是利用NO2-作為電子受體的細(xì)胞色素C，nrfBCD編碼的蛋白將電子轉(zhuǎn)移到催化亞基NrfA上，nrfEFG編碼的血紅裂解酶（Heme lyase）將血紅素（Heme group）連結(jié)到NrfA催化位點(diǎn)上［99］。nrfA基因是Nrf酶的標(biāo)記基因。Song等［100］以nrfA基因?yàn)闃?biāo)記基因?qū)γ绹?guó)北卡羅來(lái)納州一個(gè)淺瀉湖河口沉積物群落進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其中DNRA活性和nrfA基因的豐度隨有機(jī)質(zhì)含量的增加而上升，有機(jī)碳的可獲得性是DNRA群落活性的重要調(diào)節(jié)因子。

隨著對(duì)DNRA的認(rèn)識(shí)逐漸加深，DNRA也還漸成為研究的熱點(diǎn)之一［2］。在氮同化還原和異化還原作用研究中，使用的分子檢測(cè)技術(shù)有焦磷酸測(cè)序、qPCR、克隆文庫(kù)等，目前對(duì)這兩個(gè)過(guò)程的功能基因的研究還不是很多，但是隨著關(guān)注度的加深也會(huì)隨之變多。

7 氨化作用及同化作用

氨化作用（Ammonification），也稱作氮礦化作用（Nitrogen mineralization），是有機(jī)質(zhì)氮轉(zhuǎn)化為的過(guò)程（圖1）［101］。不同的有機(jī)質(zhì)需要不同的酶催化氨化作用，其中尿素酶（Urease）催化尿素的氨化作用。尿素酶可催化尿素分解為NH4+，系統(tǒng)命名為酰胺水解酶［102-103］，細(xì)菌、植物和動(dòng)物體內(nèi)都含有尿素酶，通過(guò)將尿素分解為NH4+的過(guò)程獲取能量［104］。細(xì)菌尿素酶基因簇由結(jié)構(gòu)基因、輔助基因和調(diào)節(jié)基因組成，結(jié)構(gòu)基因包括ureA、ureB和ureC基因，分別編碼α、β和γ亞基；輔助基因包括ureD、ureE、ureF、ureG、ureH、ureI等，ureR是調(diào)節(jié)基因。ureC基因編碼尿素酶維持酶活性的蛋白，是尿素酶的標(biāo)記基因［103］。

同化作用（Assimilation），又稱為合成代謝，是指生物體利用能量將小分子合成為大分子的一系列代謝途徑。所有的氮循環(huán)微生物可通過(guò)同化作用利用環(huán)境中的小分子氮化物合成含氮大分子［105］。

8 結(jié)論與展望

生態(tài)系統(tǒng)是一個(gè)整體，而氮循環(huán)并非獨(dú)立存在于生態(tài)系統(tǒng)中，氮元素不同形式轉(zhuǎn)化過(guò)程中，會(huì)偶聯(lián)其他元素的轉(zhuǎn)化過(guò)程，如碳循環(huán)、硫循環(huán)等，其中厭氧甲烷氧化和反硝化作用的偶聯(lián)就是非常典型的例子［106］。未來(lái)對(duì)氮循環(huán)的研究必然會(huì)發(fā)展為氮循環(huán)偶聯(lián)其他生物地球化學(xué)循環(huán)的研究。但不管研究的方向如何改變，分子檢測(cè)技術(shù)都是其中重要的研究手段，正如高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)完全硝化菌的過(guò)程［8-9］。單細(xì)胞測(cè)序無(wú)疑是目前最新的技術(shù)，而高通量qPCR是在普通qPCR基礎(chǔ)上研發(fā)的高通量技術(shù)［107］，雖然目前還沒(méi)有這些新技術(shù)應(yīng)用在氮循環(huán)研究中的實(shí)例，但在不久的將來(lái)，這些新技術(shù)必然會(huì)給氮循環(huán)研究帶來(lái)新的發(fā)現(xiàn)。

此外，大數(shù)據(jù)時(shí)代帶來(lái)的另一方面的需求就是數(shù)據(jù)分析平臺(tái)的建立。隨著微生物組學(xué)技術(shù)的普及，在未來(lái)數(shù)十年之內(nèi)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)平臺(tái)建設(shè)將對(duì)氮循環(huán)微生物功能基因的研究提供保障，而分析技術(shù)本身的研究和發(fā)展也非常重要，基礎(chǔ)性分析和存儲(chǔ)平臺(tái)的建設(shè)可為氮循環(huán)功能類群研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［108］。以功能基因?yàn)槠瘘c(diǎn)，以日益發(fā)展的數(shù)據(jù)分析平臺(tái)為支撐，分子檢測(cè)技術(shù)的革新能夠更深入全面地了解參與氮循環(huán)的微生物功能類群多樣性，最終為環(huán)境科學(xué)、生態(tài)學(xué)和地球科學(xué)的發(fā)展帶來(lái)新的契機(jī)。

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