耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥機(jī)制和危險(xiǎn)因素研究進(jìn)展

陶慧婷，楊旭

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，昆明650101）

腸桿菌科細(xì)菌是棲居在人和動(dòng)物腸道內(nèi)的一群形態(tài)、生物學(xué)形狀相似的革蘭陰性桿菌，在自然界廣泛分布，以人腸道菌群為主。其中大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院感染最常見的病原菌，易在胃腸道、生殖道等部位定植，當(dāng)人體免疫功能下降時(shí)則可能會(huì)導(dǎo)致感染。近年來，由于抗生素等藥物的不合理使用使耐藥株迅速增長，并以多重耐藥為顯著特點(diǎn)［1］。碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的首選藥物，但隨著此類藥物的大量使用，臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE），直接導(dǎo)致患者住院時(shí)間的延長，預(yù)后差，發(fā)病率和死亡率的日益升高。2016年中國細(xì)菌耐藥網(wǎng)（CHINET）發(fā)布監(jiān)測(cè)報(bào)告提示臨床分離菌對(duì)常用抗菌藥物的耐藥率仍呈增長趨勢(shì)［2］，對(duì)耐藥菌的檢測(cè)篩查和管理仍然為重中之重。

1 耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的耐藥機(jī)制

CRE菌株常見耐藥機(jī)制有4種：①CRE菌株產(chǎn)碳青霉烯酶；②菌株外膜蛋白表達(dá)缺失伴產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和頭孢菌素酶（AmpC）；③抗菌藥物作用靶位改變；④菌株外排泵高表達(dá)。有研究提出所有CRE菌株中約50%為產(chǎn)碳青霉烯酶類的耐藥菌［3］，其次為孔蛋白表達(dá)缺失伴產(chǎn) ESBLs和AmpC，而抗菌藥物靶位改變和外排泵高表達(dá)則較少報(bào)道。

1.1 產(chǎn)碳青霉烯酶 碳青霉烯酶是指能夠明顯水解至少亞胺培南或者美羅培南的一類β-內(nèi)酰胺酶，按 Amber分類可分為三大類：A類，B類和D類。A類和D類為絲氨酸酶，即需要絲氨酸作為其活性位點(diǎn)，而B類為金屬酶，需要金屬鋅對(duì)β-內(nèi)酰胺酶進(jìn)行水解。

A類酶包括 KPC，GES，PER，IMI／NMC-A和SME，可以水解所有的β-內(nèi)酰胺酶。A類酶可分為由質(zhì)粒編碼的 KPC和 GES，以及染色體編碼的PER，SME和IMI等兩大類。目前全球范圍內(nèi)流行的主要菌株為 ST258型的克隆株，因其攜帶blaKPC-2或blaKPC-3位于Tn3-Tn4401復(fù)合轉(zhuǎn)座子上，因此具有較強(qiáng)的傳播能力。B類MBLs亦可以水解所有的β-內(nèi)酰胺酶，但對(duì)單環(huán)胺類抗生素如氨曲南敏感，可以被金屬螯合劑如EDTA抑制，包括IMP，VIM和NDM。根據(jù)氨基酸序列的同源性可分為3個(gè)亞型，臨床工作中常見到的MBLs基本都屬于B1型［4］，而 VIM型和 IMP型的 MBLs通常嵌入Ⅰ類整合子中促進(jìn)傳播［5］。D類為 OXA酶，由blaOXA等位基因編碼，屬于不動(dòng)桿菌屬中的酶類，有較強(qiáng)的水解青霉素的能力和稍弱的水解碳青霉烯類抗生素的能力，但由于耐藥菌株中可能表達(dá)多種ESBLs，使得其對(duì)所有的β內(nèi)酰胺類藥物都有耐藥性。

A、B、D三類酶均可存在于可以水平移動(dòng)的可移動(dòng)耐藥元件中，通過接合，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)座等方式在不同菌株之間水平傳播，從而導(dǎo)致耐藥菌株的流行。結(jié)合各個(gè)國家和地區(qū)的研究文獻(xiàn)和相關(guān)報(bào)道我們得知KPC，OXA-48，VIM和NDM這4種酶可以引起全世界范圍內(nèi)的廣泛傳播，而其他碳青霉烯酶如IMP，GES，PER，SME，SIM等引起的感染則具有相對(duì)獨(dú)特的地域性。

1.2 細(xì)菌孔蛋白表達(dá)缺失伴產(chǎn)ESBLs和AmpC ESBLs和AmpC的產(chǎn)生均由質(zhì)粒編碼并常見于腸桿菌科，有學(xué)者［6］認(rèn)為這與誘導(dǎo)型或去抑制型染色體基因酶的高表達(dá)有關(guān)?？椎鞍讓儆诟锾m陰性菌外膜上的蛋白質(zhì)，由跨膜蛋白形成孔道，可允許抗菌藥物通過。當(dāng)其改變或丟失，同時(shí)伴 ESBLs和（或）AmpC高產(chǎn)時(shí)，可致抗生素在細(xì)菌外膜上的擴(kuò)散速率減緩以至于藥物不能進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部從而產(chǎn)生耐藥性。

較常見的孔蛋白有 OmpK35和 OmpK36等，Laura García-Sureda的研究［7］認(rèn)為，OmpK35的基因發(fā)生無義突變可導(dǎo)致其早期終止和孔蛋白缺失，而OmpK36的基因突變則可在不同程度上增大藥物的MICs值。Hamzaoui［8］的研究中同樣說明了上述問題。臺(tái)灣學(xué)者［9］的研究中認(rèn)為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中OmpK35的缺失更為常見，而OmpK36的缺失可導(dǎo)致厄他培南耐藥率的增加，但對(duì)亞胺培南和美羅培南沒有顯著影響。

Omp的缺失加上ESBL和（或）AmpC產(chǎn)生，在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的研究中起重要作用，非產(chǎn)酶類耐碳青霉烯類腸桿菌越來越引起人們的重視，孔蛋白與不同藥物耐藥性之間的關(guān)系是近年來的研究熱點(diǎn)，在以后的臨床工作中也可根據(jù)研究結(jié)果進(jìn)行針對(duì)性的用藥。

2 耐藥基因的分子流行病學(xué)

19世紀(jì)80年代中期，人們發(fā)現(xiàn)了碳青霉烯酶，隨后在大腸埃希菌中也發(fā)現(xiàn)了可以水解碳青霉烯類抗生素的酶類，并且在針對(duì)耐藥菌的研究中發(fā)現(xiàn)不同耐藥基因及不同地域之間他們的流行與傳播都具有差異性。

2.1 KPC酶 1996年北美一家醫(yī)院的ICU發(fā)現(xiàn)了第一株產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌，2001年美國東北部大量報(bào)道了住院患者感染產(chǎn)KPC酶的耐藥菌的案例［10］?？梢姰a(chǎn)KPC酶的耐藥菌在美國的傳播非常明顯和迅速，截至2010年，美國接受調(diào)研的26個(gè)醫(yī)療中心共195株腸桿菌科分離株中有28株（14.4%）含blaKPC-2或blaKPC-3，其中三分之一在德克薩斯州被發(fā)現(xiàn)［11］，截至2017年11月，根據(jù)美國CDC網(wǎng)站發(fā)布的結(jié)果顯示所有州均有產(chǎn)KPC酶的CRE菌株感染的報(bào)道，而這也僅僅只是耐藥菌感染的冰山一角［12］。美國 CDC使用 PFGE和MLST兩種方法分析了1996年至2008年間的耐藥菌株，發(fā)現(xiàn)近70%的耐藥菌都是產(chǎn)KPC酶的ST258型肺炎克雷伯菌［13］，結(jié)合其他研究發(fā)現(xiàn)ST258型肺炎克雷伯菌為美國的主要流行株，同時(shí)ST258型菌株發(fā)生單位點(diǎn)突變后會(huì)形成ST512型和ST11兩種型別，更加促進(jìn)了blaKPC在全球范圍內(nèi)的傳播。

以色列是繼美國之后第二個(gè)報(bào)道發(fā)現(xiàn)產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌感染的國家。其感染高峰在2007年，經(jīng)過合理監(jiān)管和干預(yù)后其傳播率有所下降。但值得注意的是，在2008年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)以色列境內(nèi)所有耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌均攜帶KPC酶，側(cè)面反映了KPC酶?jìng)鞑シ秶畯V，傳播之迅速。

自2007年在我國浙江省首次報(bào)道產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，耐碳青霉烯類大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的耐藥率從2004年的0%和0.7%上升到2014年的1.0%和13.4%，中國幾乎所有省市、自治區(qū)都有 CRE的相關(guān)報(bào)道［14］，Zhang等［15］和 Liu等［16］在2017年的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，90%的多重耐藥菌為肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌，其中產(chǎn)KPC-2的肺炎克雷伯菌占所有耐藥肺炎克雷伯菌的70%，而產(chǎn)KPC-2的大腸埃希菌占所有耐藥大腸埃希菌的40%，可見KPC-2已成為中國境內(nèi)傳播最廣泛的碳青霉烯酶。而與其他國家和地區(qū)不同的是，Zhang等［15］和Liu等［16］的研究中發(fā)現(xiàn)我國流行株為 ST11型肺炎克雷伯菌，在 Samuelsen［17］和 Qi［18］的研究中認(rèn)為ST11是ST258型肺克發(fā)生了單位點(diǎn)突變而產(chǎn)生的，故兩種型別之間可認(rèn)為是具有相關(guān)性的。

2.2 VIM酶 VIM于1996年和1997年在意大利維羅納和法國馬賽被發(fā)現(xiàn)，分別是VIM-1和VIM-2，VIM-1主要存在于腸桿菌科細(xì)菌中，而VIM-2型主要存在非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌中，目前全世界傳播更為廣泛的是VIM-2型，主要由ST147型的肺炎克雷伯菌攜帶傳播，但也有報(bào)道認(rèn)為ST11型肺炎克雷伯菌亦可攜帶 blaVIM［19-20］。Vatopoulos等［21］發(fā)現(xiàn)VIM在意大利的流行導(dǎo)致了肺炎克雷伯菌分離株中近一半對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥，同時(shí)還有向西班牙等其他國家蔓延的趨勢(shì)?？偟膩碚fVIM在全球范圍內(nèi)均有疫情報(bào)道，至2014年7月共有41種VIM亞型被發(fā)現(xiàn)，我國目前還未發(fā)生VIM的爆發(fā)性感染。

2.3 NDM酶 NDM屬于B類金屬酶類，多見于ST14型的肺炎克雷伯菌攜帶。2008年從一名在印度接受治療的瑞典患者的樣本中檢出，此后NDM在全球范圍內(nèi)迅速傳播，目前發(fā)現(xiàn)的NDM亞型共16種，以NDM-1流行最為廣泛。

印度的NDM的檢出率最高，并以NDM-1最常見，NDM-16次之。印度和巴基斯坦等地區(qū)的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)NDM檢出率已經(jīng)上升到了13.5%，同時(shí)攜帶NDM-1細(xì)菌的MLST型別呈現(xiàn)多樣性，已經(jīng)在ST11和ST147型肺炎克雷伯菌以及ST131和ST101型大腸埃希菌在內(nèi)的幾個(gè)流行耐藥菌株中均有發(fā)現(xiàn)，還在這些耐藥菌中同時(shí)發(fā)現(xiàn)攜帶了其他種類的耐藥基因，使得該耐藥菌表現(xiàn)出多重耐藥性。Chen等［22］的研究中發(fā)現(xiàn)我國攜帶blaNDM的耐藥菌株包括 ST23，ST17，ST76，ST45，側(cè)面反映了型別的多樣性。徐茶［23］發(fā)現(xiàn)3株肺炎克雷伯菌MLST分型屬于ST22型，且為同一克隆株，亦與世界范圍內(nèi)主要的流行株不同，同時(shí)徐茶等還在一新生兒患者樣本中檢出同時(shí)攜帶 NDM-1，TEM-1，fosA3，oqxA和oqxB的ST22型肺炎克雷伯菌，屬國內(nèi)外的首次報(bào)道。Zhang等［15］的研究中發(fā)現(xiàn) blaNDM在我國山西，陜西，廣西，江西等地也是主要的流行耐藥基因型。

2.4 OXA酶 OXA屬于D類酶，傳播以O(shè)XA-48為主，OXA-181次之，土耳其于2001年在肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了OXA-48。較多國家都過OXA引起感染的報(bào)道，但關(guān)于其流行性則較少提及，這可能是因?yàn)镺XA酶的水解異質(zhì)性和EDTA及克拉維酸不能抑制而導(dǎo)致的對(duì)OXA的流行的不確定性。一些報(bào)道中發(fā)現(xiàn)ST11和 ST147型肺炎克雷伯菌在產(chǎn)OXA-48酶的同時(shí)還產(chǎn) ESBLs［24］，ST131型大腸埃希菌也被報(bào)道同時(shí)含blaKPC和blaOXA-48［25］，這也證明了上文中提到的細(xì)菌可攜帶多種耐藥基因而表現(xiàn)出的多重耐藥性。

3 CRE感染的危險(xiǎn)因素和監(jiān)測(cè)方法

CRE是院內(nèi)感染的主要病原菌，感染后的死亡率為可高達(dá)50%。研究［12］認(rèn)為，醫(yī)療環(huán)境中CRE的傳播主要有兩大途徑：①患者之間，醫(yī)患之間相互傳播。如患者之間同處一個(gè)病區(qū)，接觸相同的醫(yī)護(hù)人員或共享醫(yī)療設(shè)備等進(jìn)行傳播。②CRE菌株在患者體內(nèi)發(fā)生突變，致使遺傳性也發(fā)生了變化。由于其日益上升的發(fā)病率和居高不下的死亡率使得越來越多的學(xué)者開始關(guān)注CRE感染的危險(xiǎn)因素和監(jiān)測(cè)方法。

3.1 危險(xiǎn)因素 Porwal等［26］認(rèn)為高齡患者，本身患有基礎(chǔ)疾病及并發(fā)癥的患者和機(jī)械通氣為CRE感染的危險(xiǎn)因素。Dasgupta等［27］的報(bào)道中則提出肺炎是導(dǎo)致耐藥菌感染最常見的疾病（62.07%），其次是尿路感染和中心靜脈導(dǎo)管相關(guān)血流感染。同時(shí)在針對(duì)ICU病房的調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，患者曾經(jīng)接受過抗生素治療，導(dǎo)尿和長期住在ICU病房是感染CRE的危險(xiǎn)因素。Salom?o等［28］針對(duì)急診科的 CRE定植和感染情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)急診科的CRE定植率為6.8%，患病率為18%，明顯高于其他科室，同時(shí)也在沒有危險(xiǎn)因素的患者身上發(fā)現(xiàn)了CRE定植。除了既往接受過抗生素治療，他們認(rèn)為肝臟疾病也是CRE感染的危險(xiǎn)因素之一。這可能是因?yàn)楦闻K疾病患者的免疫力較差，更容易發(fā)生院內(nèi)感染。

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)查我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)生CRE感染的科室中，急診科、ICU和手術(shù)科室是感染的“重災(zāi)區(qū)”，這可能是由于以上科室的患者大多病情危重，機(jī)體免疫力較差，大多會(huì)接受抗生素治療，與醫(yī)護(hù)人員接觸更加密切等，因而更容易發(fā)生感染。多數(shù)學(xué)者都將既往接受過抗生素治療，老齡患者，機(jī)械通氣或其他有創(chuàng)支持治療，慢性疾病，曾接受過移植或進(jìn)行免疫抑制相關(guān)治療等列為危險(xiǎn)因素。還有研究者提出感染CRE為患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而這也促使我們?cè)谄綍r(shí)的工作中將更加關(guān)注具有相關(guān)危險(xiǎn)因素的患者。

3.2 篩查和監(jiān)管 面對(duì)CRE感染率的居高不下，我們似乎應(yīng)該專注于抗菌藥物的研發(fā)，但預(yù)防耐藥菌的感染和傳播更加重要。除卻患者本身的因素，加強(qiáng)監(jiān)管也有可待改進(jìn)的地方。Schwartz-Neiderman等［29］在研究中提出感染CRE的危險(xiǎn)因素包括與感染者處于同一病區(qū)大于等于3 d，這提示一旦發(fā)現(xiàn)患者感染CRE，有效的做法是立即隔離，避免發(fā)生院內(nèi)的爆發(fā)性感染，有條件的科室可對(duì)同病區(qū)患者進(jìn)行篩查，防患于未然。在日常診療中盡量縮短住院時(shí)間，圍手術(shù)期加強(qiáng)管理等也可以減少耐藥菌的產(chǎn)生和傳播。Grabowski等［30］認(rèn)為患者感染CRE可能是由于在接受治療時(shí)醫(yī)護(hù)人員手消不夠嚴(yán)格，因此臨床醫(yī)生在接觸患者時(shí)需注意無菌操作，避免救治過程中成為細(xì)菌傳播的“橋梁”。

對(duì)具有危險(xiǎn)因素的人員提前預(yù)防，持續(xù)監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)對(duì)耐藥菌的監(jiān)管可能是預(yù)防傳播過程中較有力的方案。美國CDC建議使用肛周或直腸拭子實(shí)行CRE的常規(guī)篩查，對(duì)象包括老齡患者，外來人口，長期住院或轉(zhuǎn)院的患者，接受過移植或長期使用免疫抑制劑的患者等，同時(shí)建議對(duì)CRE感染者同病區(qū)的患者進(jìn)行篩查，從傳播源頭進(jìn)行預(yù)防和控制。

我國目前暫無相關(guān)條款，但醫(yī)院在預(yù)防CRE爆發(fā)性感染方面可以根據(jù)各個(gè)地方的流行病學(xué)特點(diǎn)加強(qiáng)防范意識(shí)，在耐藥菌傳播的高發(fā)科室如ICU，急診科和手術(shù)科室等先實(shí)行小范圍的篩查。

4 總結(jié)

全球范圍內(nèi)仍以產(chǎn)KPC酶的肺炎克雷伯菌為主要傳播菌株，產(chǎn)酶類耐藥菌的比例約占所有耐藥菌的一半，但非產(chǎn)酶類耐藥菌也在逐漸引起重視。目前仍然有新的耐藥基因或亞型不斷被發(fā)現(xiàn)，耐藥菌也大多表現(xiàn)出多重耐藥性，給臨床治療帶來較大壓力。盡管當(dāng)下各個(gè)國家和地區(qū)對(duì)抗生素的使用已加強(qiáng)管理，CRE的感染率仍然在不斷上升，并以其高死亡率繼續(xù)威脅著患者的生命。通過研究CRE的耐藥機(jī)制，流行病學(xué)特征和危險(xiǎn)因素等，可盡可能早地預(yù)知感染的發(fā)生和發(fā)展，同時(shí)建立耐藥菌的篩查制度，在對(duì)癥治療的同時(shí)從源頭對(duì)CRE的感染和傳播進(jìn)行干預(yù)，在臨床工作中早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療。