三維組織藥敏法在腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用

紀(jì) 巧 陳 麗 綜述 何遠(yuǎn)橋 審校

2017年2月，國家癌癥中心公布了2013年中國惡性腫瘤的發(fā)病和死亡數(shù)據(jù)，與2012年相比，癌癥新發(fā)病例數(shù)持續(xù)上升，從358萬增加到368萬，增幅達(dá)到3%，占世界新發(fā)病例(約1 409萬)的1/4，每天約有1萬人確診為癌癥[1]。傳統(tǒng)惡性腫瘤的治療手段包括放療、化療、免疫治療、中藥等，其中化療大多采用美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National comprehensive cancer network，NCCN)指南推薦的標(biāo)準(zhǔn)化療方案，忽略了腫瘤內(nèi)在固有的異質(zhì)性，比如：一項(xiàng)經(jīng)典的Ⅲ期臨床試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，多西紫杉醇、順鉑和氟尿嘧啶三聯(lián)化療方案治療晚期轉(zhuǎn)移性胃癌的客觀有效率僅為57.7%，并具有嚴(yán)重的毒副反應(yīng)[2]。然而，實(shí)現(xiàn)“個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療”卻能有效地解決傳統(tǒng)治療手段的針對性低、毒副作用明顯、藥品無效耗費(fèi)率高等問題[3]。個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療(Individualized precision medicine)的本質(zhì)是利用醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)或基因組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)治療的目的，提高疾病診治與預(yù)防的效益[4-5]，由于三維組織藥敏法(Histoculture drug response assay，HDRA)能有效地預(yù)測化療藥物敏感性、耐藥性，所以HDRA是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療的重要手段之一[6]。

腫瘤藥敏試驗(yàn)方法可以預(yù)測患者對不同化療藥物的敏感性，實(shí)現(xiàn)患者的個(gè)體化精準(zhǔn)給藥，它是個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療的核心內(nèi)容之一[7-9]。腫瘤藥敏試驗(yàn)方法共分為體內(nèi)、外兩大類，體外藥敏實(shí)驗(yàn)包括3-(45-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法、三磷酸腺苷(ATP-TCA)法、膠原凝膠液滴培養(yǎng)(CD-DST)法、流式細(xì)胞儀法、細(xì)胞凋亡法、乳酸脫氫酶(LDH)檢測、HDRA等。其中，大多數(shù)的體外藥敏試驗(yàn)本質(zhì)是單層細(xì)胞培養(yǎng)藥敏法，難以模擬原腫瘤組織的異質(zhì)性及再現(xiàn)腫瘤微環(huán)境。HDRA是20世紀(jì)80年代末出現(xiàn)并不斷被改進(jìn)和發(fā)展的一種體外藥敏實(shí)驗(yàn)方法[10]，它不僅實(shí)驗(yàn)周期短，還維持了腫瘤組織三維的生長方式、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞異質(zhì)性和致瘤性等多種體內(nèi)特性，可模擬細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞間相互黏附作用、信息傳導(dǎo)等，更接近于體內(nèi)和臨床的實(shí)際情況[11-15]。因此，本文就HDRA在腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用做一綜述。

1 HDRA的發(fā)展史

1912年，Alexis carrel通過體外低滲血培養(yǎng)雞胚心臟組織發(fā)現(xiàn)，雞胚心臟組織能長期存活并維持其收縮功能，證明了組織體外培養(yǎng)是可行的[16]。1985年，美國加州大學(xué)圣地亞哥分校Hoffman團(tuán)隊(duì)證明了腫瘤組織在三維培養(yǎng)的條件下可以長期存活并維持類似體內(nèi)環(huán)境下的組織結(jié)構(gòu)特征，奠定了HDRA檢查技術(shù)的基礎(chǔ)[10]。1987年，Hoffman團(tuán)隊(duì)又報(bào)道了腫瘤組織在三維培養(yǎng)的條件下檢查化療藥物的敏感性與體內(nèi)腫瘤相似，率先提出了HDRA藥敏法可為個(gè)別癌癥患者篩選有效的抗癌藥物[11]。

目前HDRA在腫瘤研究領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，比如實(shí)體腫瘤的藥敏檢測、新藥的開發(fā)和篩選等，為使其操作變得更簡便、靈敏、可靠，學(xué)者們在應(yīng)用的過程中分別對其做了以下幾點(diǎn)改良。首先，研發(fā)了多種三維組織塊的支持物，比如：網(wǎng)狀物、膠原凝膠、明膠海綿等，但目前市場上應(yīng)用最廣泛的是明膠海綿[17]。而且，他們還將最初6孔板改成了24孔板[18]，以便用來檢測更多藥物。其次，早期HDRA利用H3 TdR放射性自顯影技術(shù)進(jìn)行檢測，耗時(shí)長、費(fèi)用高、操作復(fù)雜，且有輻射，不利于臨床推廣?，F(xiàn)要在HDRA通過利用MTT、MTS、CCK-8法檢測，這三種方法都是通過測定吸光度值來間接反映活細(xì)胞數(shù)目[19]。MTT因價(jià)格便宜，使用非常廣泛，而MTS和CCK8因?qū)嶒?yàn)操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)應(yīng)用持續(xù)增多[20]。

2 HDRA在各種惡性腫瘤藥敏檢測中的應(yīng)用

2.1 HDRA在肺癌藥敏檢測中的應(yīng)用

肺癌高居我國惡性腫瘤死亡和發(fā)病的首位[21]。Yoshimasu等[22]回顧性分析了359例肺癌患者的HDRA檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HDRA可評價(jià)率為97.4%，真陽性率為73.2%，真陰性率為100%，敏感性100%，特異性68.1%，準(zhǔn)確性達(dá)到了83.0%，具有良好的預(yù)測性。而高隆等[23]采用了MTT法進(jìn)行肺癌體外藥物敏感性測定，與臨床治療結(jié)果符合率為 89.3% ，陽性符合率為 90. 9% ，陰性符合率為77.8% ，試驗(yàn)敏感性為 96.8% ，特異性為 53.8%。兩種方法相比，HDRA預(yù)測肺癌與敏感性、特異性明顯優(yōu)于MTT法，更有利于肺癌患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療。

此外，Yoshimasu團(tuán)隊(duì)[24]又對22例非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行HDRA檢測，其中包括16個(gè)腺癌患者，4個(gè)鱗狀細(xì)胞癌患者以及2個(gè)類癌型患者，他們發(fā)現(xiàn)，吉非替尼抑制率與其濃度呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。非吸煙組腺癌20 μg/mL的抑制率(39.2%±35.1%，n=6)高于吸煙組腺癌(2.2%±5.0%，n=10，P=0.001)及非腺癌組的抑制率(16.9%±23.6%，n=6，P=0.09)，研究結(jié)果認(rèn)為，HDRA可以評估非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼的敏感性，但文章同時(shí)也指出，腫瘤組織塊是離體組織，無血管支持。在理論上，失去血管支持的腫瘤組織預(yù)測抑制血管生成的靶向藥物的敏感性是不可行的[25]，但實(shí)際上，對于HDRA到底能否預(yù)測靶向藥物的敏感性，還存在著巨大爭議，HDRA確切的作用機(jī)制也有待于更進(jìn)一步的研究。

2.2 HDRA在胃腸道腫瘤藥敏檢測中的應(yīng)用

目前中晚期胃腸道腫瘤化療有效性尚不盡人意[26]。運(yùn)用HDRA預(yù)測胃腸道腫瘤輔助化療藥物的敏感性，有利于胃腸道腫瘤的個(gè)體化精準(zhǔn)治療，提高胃癌患者的生存期。Hoffman等[27]納入107例晚期胃癌和109例晚期結(jié)直腸癌患者，并檢測其對絲裂霉素C、多西他賽、5-氟尿嘧啶和順鉑的化學(xué)敏感性，其中有208例(96.3%)完成了HDRA，但實(shí)際上只有38例患者的HDRA結(jié)果與臨床結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩者的符合率高達(dá)92.1%，真陽性率66.7%，真陰性率100%，敏感性為100%，特異性為90.6%。雖然人腫瘤細(xì)胞集落形成測定法可以直接評價(jià)細(xì)胞增殖死亡，但臨床標(biāo)本檢測率低[28]，而HDRA臨床檢查檢測成功率高達(dá)96.3%。上述表明HDRA能有效預(yù)測胃腸道腫瘤術(shù)后輔助化療藥物的敏感性和耐藥性，根據(jù)其結(jié)果指導(dǎo)治療，有利于胃腸道腫瘤的個(gè)體化精準(zhǔn)治療。此外，術(shù)前新輔助化療可以提高胃腸道癌根治性手術(shù)的切除率[29]，未來，HDRA是否同樣可用于預(yù)測術(shù)前新輔助化療藥物的敏感性，需要更多的深入研究。

2.3 HDRA在乳腺癌藥敏檢測中的應(yīng)用

乳腺癌已經(jīng)成為全球女性發(fā)病率和死亡率的首要病因[30]。Tanino等[31]研究共納入24例復(fù)發(fā)乳腺癌患者和127例原發(fā)乳腺癌，比較使用多種化療藥物對原發(fā)乳腺癌及復(fù)發(fā)乳腺癌的抑制率。順鉑，5-氟尿嘧啶和絲裂霉素C作為測試藥物，原發(fā)乳腺癌與復(fù)發(fā)乳腺癌在HDRA檢測中均加入絲裂霉素C的抑制率分別為59.9%和42.8%；加入5-氟尿嘧啶的抑制率分別為49.0%和33.4%；加入順鉑的抑制率分別為34.5%和16.0%，平均抑制率分別為57.9%和38.6%，其中復(fù)發(fā)乳腺癌有64.7%對4種藥物均耐藥，而原發(fā)乳腺癌僅有27%，另外，復(fù)發(fā)乳腺癌僅有5.9%的患者對三種或多種藥物敏感，最后分析了所有患者的HDRA結(jié)果與臨床結(jié)果，發(fā)現(xiàn)臨床相關(guān)性為80.0%。因此，運(yùn)用HDRA可以為臨床決策特別是可以為克服復(fù)發(fā)乳腺癌多藥耐藥性問題提供個(gè)性化的指導(dǎo)。

另外，專家們已經(jīng)公認(rèn)化療聯(lián)合內(nèi)分泌治療能明顯延長乳腺癌等多種內(nèi)分泌惡性腫瘤患者的生存期，那么，HDRA是否也可以用來預(yù)測內(nèi)分泌藥物的敏感性？筆者認(rèn)為，這是一個(gè)非常值得做深入研究的“熱點(diǎn)”。

2.4 HDRA在頭頸部腫瘤藥敏檢測中的應(yīng)用

頭頸部腫瘤是全球第六大常見惡性腫瘤[32]，手術(shù)聯(lián)合放療、化療等是其主要治療手段[33]。HDRA可以預(yù)測頭頸部腫瘤對化療藥物的敏感性。Singh等[34]運(yùn)用HDRA來預(yù)測頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的生存期，該研究共納入42例患者，其中41例患者成功完成了HDRA，研究結(jié)果顯示有13例患者(32%)對5-氟尿嘧啶耐藥，13例患者(32%)對順鉑耐藥，11例患者(27%)對兩種藥物均耐藥。同時(shí)也比較了耐藥的患者和敏感的患者之間的2年生存率，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，5-氟尿嘧啶敏感組與耐藥組2年生存率分別為85%vs. 64%，順鉑敏感組與耐藥組2年生存率分別為86%vs. 64%，對這兩種藥物均敏感組與耐藥組2年生存率為85%vs. 63%。以上研究表明，HDRA對預(yù)測頭頸部腫瘤的臨床相關(guān)性高達(dá)70%以上。HDRA優(yōu)點(diǎn)在于具有較高的成功率，有利于敏感性及耐藥性的比較研究，且與頭頸部腫瘤臨床相關(guān)性高。HDRA缺點(diǎn)為忽視頭頸部惡性腫瘤不同病理類型之間是存在內(nèi)在固有的差異性的，比如，頭頸部腫瘤包括了鼻咽癌，鼻咽癌的治療以放化療為主，一般不主張進(jìn)行手術(shù)切除治療[35]，導(dǎo)致獲取腫瘤組織比較困難。

總之，HDRA在頭頸部腫瘤中的應(yīng)用，可根據(jù)其病理、部位等相關(guān)結(jié)果進(jìn)行更加細(xì)化的分類研究，因此，未來還有很多工作需要我們?nèi)ネ瓿伞?/p>

2.5 HDRA在其他腫瘤藥敏檢測中的應(yīng)用

除上述腫瘤以外，HDRA也指導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、食管癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤患者的個(gè)體化精準(zhǔn)治療。且不同類型的腫瘤與臨床相關(guān)性如下：子宮內(nèi)膜癌93%[36]，卵巢癌97%[37]，食管癌89.3%[13]，膀胱癌80%[37]。

3 HDRA的局限性與未來的發(fā)展趨勢

HDRA在腫瘤個(gè)性化精準(zhǔn)醫(yī)療中的應(yīng)用還存在一定的不足。首先，HDRA需要較大體積的腫瘤組織(約1 cm3)，但很多腫瘤在早期組織較小或者手術(shù)可切除率不高，無法獲取足夠量的組織進(jìn)行檢測[38]。其次，HDRA也并非適用于任何腫瘤，如腎癌、前列腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤對化療藥物普遍不敏感，這導(dǎo)致HDRA的臨床應(yīng)用受到限制。再者，HDRA對靶向藥物特別是抑制血管生成的靶向藥物的研究，在理論上是不可行的，但是，有研究檢測了抑制血管生成的靶向藥物的敏感性，其結(jié)果呈陽性，它的作用機(jī)制仍有待于做進(jìn)一步的研究。最后，內(nèi)分泌藥物是用來治療內(nèi)分泌腫瘤非常重要的方法之一，HDRA除了可用于預(yù)測化療藥物的敏感性和耐藥性之外，未來還能否用于預(yù)測內(nèi)分泌藥物的敏感性和耐藥性，值得我們做進(jìn)一步的探索和研究。

為了更好地發(fā)揮HDRA檢測技術(shù)的優(yōu)勢，有研究者將HDRA聯(lián)合了其他技術(shù)方法，以此來取長補(bǔ)短。首先，HDRA聯(lián)合人源性腫瘤組織異種移植(Patient-derived xenograft，PDX)模型。利用穿刺活檢等方法，獲取少量腫瘤組織，接種免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤，待腫瘤組織擴(kuò)增后，再進(jìn)行HDRA檢測，以期為臨床個(gè)體化藥敏方案的篩選和新藥的研發(fā)作服務(wù)。Delyon等[18]完成了2例黑色素瘤PDX-HDRA實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)，PDX-HDRA和PDX模型的體內(nèi)藥敏法都對鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1(BRAF)和絲裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制劑有著顯著應(yīng)答，都與臨床患者靶向治療反應(yīng)一致。其次，HDRA聯(lián)合qPCR、Western blot技術(shù)，能有效地預(yù)測腫瘤個(gè)體化的生物標(biāo)記物，比如，中國學(xué)者袁庶強(qiáng)利用HDRA聯(lián)合qPCR、Western blot分析了結(jié)直腸癌化療敏感性與多藥耐藥基因蛋白表達(dá)之間的關(guān)系[39]。最后，HDRA也聯(lián)合了其他更多的技術(shù)，比如2個(gè)HDRA組成ITRA、HDRA聯(lián)合類器官、HDRA聯(lián)合代謝組學(xué)等，關(guān)于HDRA聯(lián)合其他技術(shù)方法，還有很多可能需要我們?nèi)ヌ剿髋c研究。

4 小結(jié)與展望

HDRA與傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)藥敏法相比具有明顯的優(yōu)勢，但HDRA內(nèi)在固有的局限性，限制了其在腫瘤領(lǐng)域的廣發(fā)應(yīng)用。隨著HDRA檢測方法的不斷發(fā)展完善及聯(lián)合其他技術(shù)方法，在腫瘤領(lǐng)域必將得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)，有望在腫瘤個(gè)體化化療方案的篩選中發(fā)揮關(guān)鍵作用。