李 潔,李 霞,劉艷明*,祝建華,孫言弟

(1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院,山東 濟(jì)南 250101；2.浪潮集團(tuán)有限公司,山東 濟(jì)南 250101)

“芝麻香”通常被認(rèn)為是芝麻香型白酒的代名詞,芝麻香型白酒是新中國(guó)成立后兩大創(chuàng)新香型(芝麻香型與兼香型白酒)之一。芝麻香型白酒是以芝麻香為主體,兼有濃、清、醬三種香型之所長(zhǎng)[1],是中國(guó)“十一大香型”中最年輕的一個(gè)成員,同時(shí)也是釀造技術(shù)難度最大、釀造條件要求最高,對(duì)環(huán)境要求最嚴(yán)格的一個(gè)香型。作為芝麻香白酒的特征成分—3-甲硫基丙醇(3-methylthio propanol,3-MP),其含量影響著芝麻香型白酒的風(fēng)味特征和香型[2],對(duì)酒的風(fēng)格和質(zhì)量起重要作用,因此對(duì)3-甲硫基丙醇的檢測(cè)技術(shù)研究也就具有重要意義。

3-甲硫基丙醇為淡黃色易流動(dòng)液體,又叫菠蘿醇,是國(guó)家允許使用的食品用香料[3-4],低濃度時(shí)有強(qiáng)烈芬芳的肉或肉湯香氣和滋味,可作為食用香精添加到水果、蔬菜、醬油、酒中,天然品存在于番茄、果酒、葡萄酒及醬油的揮發(fā)成分中[4-7]；化學(xué)分子式為C4H10OS,分子質(zhì)量為106.18 Da,根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 20824—2007《芝麻香型白酒》[8]規(guī)定,低酒精度酒(18%vol～40%vol)中3-甲硫基丙醇的含量≥0.4mg/L,高酒精度酒(41%vol～68%vol)中含量≥0.5mg/L,目前測(cè)定3-甲硫基丙醇含量的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 10345—2007《白酒分析方法》[9],但由于酒中揮發(fā)性成分較多,測(cè)定時(shí)干擾多,峰形不好,且在氫火焰離子化檢測(cè)器上的響應(yīng)比較低,難以實(shí)現(xiàn)高效、靈敏的檢測(cè)。

目前關(guān)于3-甲硫基丙醇檢測(cè)的報(bào)道有二氯甲烷提取濃縮法[10]、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS法)[11]、氣相色譜-質(zhì)譜/選擇離子掃描法(gas chromatography-mass spectrometer/selected ion mon itor,GC-MS/SIM)[12]、GC-MS/SIM內(nèi)標(biāo)法[13]、分散液液微萃取結(jié)合氣相色譜法[14]等。張小溪等[15]建立了GC-MS法檢測(cè)釀酒酵母發(fā)酵液中的3-甲硫基丙醇的方法,程偉等[16]建立了GC-MS法測(cè)定糧醅中的3-甲硫基丙醇。本實(shí)驗(yàn)研究了內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法對(duì)3-甲硫基丙醇定量的影響,并對(duì)3-甲硫基丙醇在火焰離子化檢測(cè)器(flame ionization detector,FID)和火焰光度檢測(cè)器(flame photometric detector,FPD)上的響應(yīng)進(jìn)行了比對(duì),建立了一種快速、靈敏、高選擇性檢測(cè)3-甲硫基丙醇的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)水乙醇(分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-甲硫基丙醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(99.6%):多倫多研究化學(xué)品公司；乙酸正戊酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(99.0%):上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；芝麻香型原酒酒樣:山東景芝酒業(yè)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Aglient 7890B氣相色譜儀(配有火焰離子化檢測(cè)器):美國(guó)安捷倫公司；GC2010-plus氣相色譜儀(配有火焰光度檢測(cè)器、硫?yàn)V光片):日本島津公司；A-11型超純水機(jī):密里博公司；MS204S電子天平:瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相樣品分析

取酒樣于進(jìn)樣瓶中,采用GC-FPD法進(jìn)行分析[10]。

1.3.2 色譜條件

色譜柱:CP-WAX型毛細(xì)管柱(50m×0.25mm×0.2μm)；載氣:氮?dú)?N2)；流速:1.0 mL/min,恒線速度模式；進(jìn)樣口溫度240℃,進(jìn)樣量1 μL,不分流進(jìn)樣；升溫程序:初始溫度50℃,以10℃/min升至200℃,保持5 min；檢測(cè)器FPD(硫?yàn)V光片)溫度為260℃,氫氣:62.5 mL/min,空氣:90 mL/min。

1.3.3 定量方法

準(zhǔn)確稱取3-甲硫基丙醇100 mg于100 mL容量瓶中,用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容,配成1 000 mg/L的儲(chǔ)備液,取此儲(chǔ)備液用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇稀釋成0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5mg/L、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L的使用液,以3-甲硫基丙醇含量(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,外標(biāo)法定量。將色譜峰信噪比(S/N)＞3的濃度確定為檢出限(limit of detection,LOD),線性范圍的最低點(diǎn)濃度確定為定量限(limit of quantitation,LOQ)。

2 結(jié)果與分析

2.1 校準(zhǔn)曲線的擬合方式與線性范圍、檢出限、定量限的考察

對(duì)一系列質(zhì)量濃度為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L的3-甲硫基丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行GC-FPD分析,以質(zhì)量濃度-峰面積進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用一次線性關(guān)系擬合法將質(zhì)量濃度(x)與峰面積(y)進(jìn)行線性擬合,結(jié)果見(jiàn)圖1A,按照鐘偉燕[17]的方法對(duì)質(zhì)量濃度(x)與峰面積(y)進(jìn)行二次線性關(guān)系擬合,結(jié)果見(jiàn)圖1B。

圖1 3-甲硫基丙醇含量-峰面積一次線性擬合(A)和二次線性擬合(B)結(jié)果Fig.1 Linear fitting(A)and quadratic linear fitting(B)results of concentration-peak area of 3-methylthio propanol

從圖1A可以看出,通過(guò)一次線性擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系并不好,R2=0.959 6,峰面積和3-甲硫基丙醇濃度明顯不呈一次線性關(guān)系,并且在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi),峰面積增加的速度明顯大于3-甲硫基丙醇濃度增加的速度,即在高質(zhì)量濃度時(shí)顯示出比低質(zhì)量濃度時(shí)有更高的靈敏度。從圖1B可以看出,經(jīng)過(guò)二次線性擬合的曲線基本上和原有的數(shù)據(jù)點(diǎn)重合,顯示峰面積和濃度呈現(xiàn)良好的二次線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

在FPD檢測(cè)器上,色譜峰峰面積和3-甲硫基丙醇質(zhì)量濃度存在特殊關(guān)系,明顯不同于日常所用的一元線性回歸。這是因?yàn)楹蚧衔镌诟粴浠鹧嬷腥紵龝r(shí),形成激發(fā)態(tài)的S2*分子,此分子回到基態(tài)時(shí)發(fā)射出波長(zhǎng)為394 nm的特征光,屬于二次響應(yīng),激發(fā)過(guò)程如下所示[18]:

特征光經(jīng)濾光片濾光,再由光電倍增管進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換后,產(chǎn)生相應(yīng)的光電流,經(jīng)放大器放大后由記錄系統(tǒng)記錄下相應(yīng)的色譜。因此采用二次線性擬合法,得出線性方程為y=583476.1x2+1648 312x-310 670.0,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9,線性范圍為0.1～10 mg/L。檢出限(LOD)為0.03 mg/L,定量限(LOQ)為線性范圍的最低點(diǎn)0.1 mg/L。

2.2 加標(biāo)回收率和精密度考察

在10mL的體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液中,分別添加20μL、100 μL、500 μL質(zhì)量濃度為100 mg/L的3-甲硫基丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,形成0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L3個(gè)質(zhì)量濃度水平的溶液進(jìn)樣分析,各添加水平條件下的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)；對(duì)3個(gè)濃度水平的溶液連續(xù)測(cè)樣3 d,每天測(cè)3次,每?jī)纱伍g隔2 h,計(jì)算日內(nèi)精密度(RSD1)和日間精密度(RSD2),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收試驗(yàn)及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of adding standard tests and degree of precision

由表1可知,GC-FPD法測(cè)定3-甲硫基丙醇結(jié)果的平均回收率為93.1%～104.6%；日內(nèi)精密度(RSD1)為3.2%～4.9%；日間精密度(RSD2)為1.1%～2.1%。表明該方法的準(zhǔn)確度、精密度良好。

2.3 GC-FPD法與GC-FID法對(duì)比

應(yīng)用建立的GC-FPD法對(duì)芝麻香型陽(yáng)性酒樣進(jìn)行了分析檢測(cè),GB/T 10345-2007《白酒分析方法》[9]中3-甲硫基丙醇的檢測(cè)方法(GC-FID內(nèi)標(biāo)法)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和酒樣色譜圖分別見(jiàn)圖2A和圖2B,GC-FPD法標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品色譜圖分別見(jiàn)圖2C和圖2D。

圖2 3-甲硫基丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在FID(A)和FPD(C)上的色譜圖以及陽(yáng)性酒樣在FID(B)和FPD(D)上的色譜圖Fig.2 Chromatogram of 3-methylthio propanol standard solution of FID(A)and FPD(C),and the positive wine sample of FID(B)and FPD(D)

由圖2A可知,保留時(shí)間為31.779min處的色譜峰為3-甲硫基丙醇的峰,標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.44 mg/L時(shí)響應(yīng)很低,峰面積僅為0.765 pA,為基線噪聲的4倍,且隨著柱溫箱的升高,基線也隨之升高,對(duì)色譜峰峰形產(chǎn)生明顯影響。由圖2C可知,保留時(shí)間15.9 min處的尖銳對(duì)稱色譜峰為3-甲硫基丙醇的峰,在質(zhì)量濃度為0.22 mg/L時(shí)響應(yīng)很高,且基線平穩(wěn),附近沒(méi)有干擾峰出現(xiàn)。

由圖2B可知,目標(biāo)峰3-甲硫基丙醇(出峰時(shí)間31.790min)附近有很多干擾峰,這是因?yàn)镕ID作為一種通用型檢測(cè)器,幾乎對(duì)所有的有機(jī)化合物都有響應(yīng),且白酒中揮發(fā)性成分較多,基質(zhì)復(fù)雜,容易對(duì)目標(biāo)峰產(chǎn)生干擾,因此對(duì)色譜條件要求較高；由于3-甲硫基丙醇在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中含量低微[8](低酒精度酒≥0.4 mg/L,高酒精度酒≥0.5 mg/L),而FID法的檢出限約為0.4 mg/L[11],微小的雜質(zhì)峰將嚴(yán)重影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性,甚至無(wú)法定性,更不能準(zhǔn)確定量,難以達(dá)到檢測(cè)要求。由圖2D可知,色譜圖基線很平穩(wěn),僅在保留時(shí)間15.1 min(干擾峰)和15.9 min處出現(xiàn)兩個(gè)峰形特別尖銳的色譜峰,這是因?yàn)榕溆辛驗(yàn)V光片的FPD僅對(duì)含硫化合物具有特異性響應(yīng),可排除大量溶劑峰及烴類的干擾。3-甲硫基丙醇以S2*分子的形式發(fā)射出波長(zhǎng)為394 nm的特征光,光電倍增管將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào),產(chǎn)生相應(yīng)的光電流,經(jīng)放大器放大后記錄在色譜圖上[20],因此靈敏度很高,檢出限為0.03 mg/L,定量限為0.1 mg/L,滿足測(cè)定要求。

2.4 酒樣結(jié)果分析

取芝麻香型陽(yáng)性樣品分別添加質(zhì)量濃度為0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.2 mg/L 3個(gè)水平的3-甲硫基丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,用GC-FID內(nèi)標(biāo)法和GC-FPD法進(jìn)樣檢測(cè)分析,各添加水平下的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表2。

表2 兩種方法測(cè)定酒樣的結(jié)果分析Table 2 Results analysis ofBaijiusample by two methods determination

由表2可知,GC-FID內(nèi)標(biāo)法和GC-FPD法酒樣中3-甲硫基丙醇檢測(cè)結(jié)果分別為0.830 mg/L和0.880 mg/L,保留時(shí)間分別為31.8 min和15.9 min,GC-FPD法用時(shí)較短。從平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)看,GC-FPD法在0.4 mg/L、0.8 mg/L和1.2mg/L三個(gè)濃度水平的平均回收率分別為93.7%、95.4%、97.8%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.9%、2.2%和3.4%；GC-FID內(nèi)標(biāo)法相較于GC-FPD法,不僅回收率低,結(jié)果的精密度也差?？赡苡捎趦?nèi)標(biāo)法是單點(diǎn)定量,對(duì)于濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度差別較大的樣品檢測(cè)結(jié)果偏差較大,不適合于多個(gè)濃度梯度的樣品的檢測(cè),且酒中復(fù)雜基質(zhì)對(duì)目標(biāo)峰產(chǎn)生干擾,影響定量。

3 結(jié)論

利用火焰光度檢測(cè)器(配有硫?yàn)V光片)對(duì)含硫化合物具有的特異性響應(yīng),建立了一種簡(jiǎn)便、快捷、高選擇性、高靈敏的檢測(cè)芝麻香型白酒中3-甲硫基丙醇的方法,檢測(cè)時(shí)間短,且響應(yīng)與濃度呈二次線性關(guān)系,靈敏度高；由于對(duì)含硫化合物的特異性響應(yīng),此法干擾少,峰形好,很好地解決了白酒中多種揮發(fā)性成分產(chǎn)生的基質(zhì)干擾問(wèn)題。在質(zhì)量濃度0.1～10 mg/L范圍,線性良好,相關(guān)系數(shù)為0.999 9；檢出限為0.03 mg/L,定量限0.1 mg/L,與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法的檢出限0.4mg/L相比,靈敏度高,達(dá)到了檢測(cè)要求。該方法易于操作、定量準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好,可作為日常檢驗(yàn)方法,適用于芝麻香型白酒特征組分3-甲硫基丙醇的檢測(cè)。

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