響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化諾麗果黃酮微波輔助提取工藝

崔 鵬,賈增杰,李瑞杰

(1.黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程系,河南 開(kāi)封 475004；2.開(kāi)封市綠色涂層材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 開(kāi)封 475004)

諾麗又名四季果,用于醫(yī)藥方面已有上千年時(shí)間[1-2]。諾麗果中的成分對(duì)很多病癥具有明顯的效果,如抗氧化、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、降血壓、糖尿病、自身免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病、痤瘡等[3-5]。

黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取方法有很多種,目前比較常見(jiàn)的有浸提法、萃取法、酶解法、超聲法、微波法等。其中浸提法較為成熟,但提取緩慢,所需溶劑量過(guò)多,提取效率低。酶解法效率有所提高,但提取時(shí)間仍然較長(zhǎng)。超聲法提取速度快、溶劑使用量少、操作簡(jiǎn)便,但黃酮提取純度不高[6-7]。萃取法消耗成本較大,現(xiàn)在還在研究階段。微波提取法能夠減少溶劑使用量[8-10],且大大提高提取效率,因此,本試驗(yàn)將單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法相結(jié)合,研究諾麗果黃酮物質(zhì)的微波輔助最佳提取工藝,以期建立一種高效、清潔、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的提取方法[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾麗果:中國(guó)海南；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%):中國(guó)藥品生物制品鑒定所；無(wú)水乙醇(分析純):安徽安特食品股份有限公司；亞硝酸鋁(分析純):焦作市化工三廠；氫氧化鈉、硝酸鋁(均為分析純):天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；過(guò)氧化氫(分析純):天津市富宇精細(xì)化工有限公司；硫酸亞鐵(分析純):天津市大茂化學(xué)試劑廠；水楊酸(分析純):天津市永大化學(xué)試劑有限公司；1,1-二基-2-苦基肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(分析純):上海如吉生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限公司；ISO9001超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng):南京先歐儀器制造有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵:河南智誠(chéng)科技發(fā)展有限公司；FA2004N電子天平:上海精密科學(xué)儀器有限公司；101-1A電熱鼓風(fēng)干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微波輔助提取

將諾麗果洗凈、自然風(fēng)干后切成片狀,放在烘箱中110℃干燥至質(zhì)量恒定,研磨并過(guò)200目篩,置于棕色瓶備用。參照廉琪等[14-16]的方法,取一定量的樣品,加入相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)的乙醇,攪拌并靜置15 min,在不同功率條件下,選擇不同的提取時(shí)間,制得待測(cè)樣品液。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與黃酮提取率計(jì)算

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.000 0mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,配制成質(zhì)量濃度為0.2000mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。移液管移取0、2.50mL、5.00mL、7.50 mL、10.00 mL、12.50 mL此溶液于25 mL容量瓶,依次加入5%NaNO2溶液1.00 mL、10%Al(NO3)3溶液1.00 mL和4%NaOH溶液10.00mL,每次加入試劑后均搖勻靜置5min,定容于25 mL容量瓶中,搖勻并靜置15 min。于波長(zhǎng)505 nm處測(cè)定吸光度值。諾麗果中總黃酮質(zhì)量濃度按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程進(jìn)行計(jì)算。黃酮提取率計(jì)算公式如下:

式中:Y為樣品中黃酮提取率,mg/g；C為諾麗果中黃酮類(lèi)化合物的質(zhì)量濃度,mg/mL；V1為稀釋體積,mL；V2為樣品溶液體積,mL；m為樣品質(zhì)量,mg；V3為取樣體積,mL。

1.3.3 諾麗果中總黃酮的提取單因素試驗(yàn)

乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響:固定液料比30∶1(mL∶g),微波提取時(shí)間3 min,微波功率400 W,在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%條件下進(jìn)行提取試驗(yàn),探討不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響。

液料比對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響:固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,微波提取時(shí)間3 min,微波功率400 W,在液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1(mL∶g)條件下進(jìn)行提取試驗(yàn),探討不同液料比對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響。

提取時(shí)間對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響:固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,液料比50∶1(mL∶g),微波功率400 W,于微波提取時(shí)間分別為1 min、2 min、3 min、4 min、5 min條件下進(jìn)行提取試驗(yàn),探討不同微波提取時(shí)間對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響。

微波功率對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響:固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,液料比50∶1(mL∶g),微波提取時(shí)間3 min,于微波提取功率分別為100W、200W、300W、400W、500W、600W、700 W條件下進(jìn)行提取試驗(yàn),探討不同微波提取功率對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照蔣益花等[17-19]的方法,依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,采用(Box-Behnken design,BBD)法設(shè)計(jì)4因素3水平的試驗(yàn),因素分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、液料比(B)、微波輔助提取時(shí)間(C)、微波功率(D)；-1、0、1(代表每個(gè)自變量的低、中、高水平)；諾麗果中黃酮的提取率(Y)作為響應(yīng)值,因素與水平編碼見(jiàn)表1。

表1 諾麗果黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for extraction process optimization of flavonoids from Noni

1.3.5 測(cè)定方法[20-21]

(1)DPPH自由基清除率的測(cè)定

配制質(zhì)量濃度0.200 0 mg/mL的DPPH溶液,放至冰箱避光保存?zhèn)溆谩Ｈ〔煌|(zhì)量濃度樣品2.00 mL,加入已配制的DPPH溶液,搖勻,暗處反應(yīng)30 min。以體積分?jǐn)?shù)100%的乙醇為參比,在波長(zhǎng)517nm處測(cè)吸光度值。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下:

式中:Ai為DPPH溶液吸光度值；Ax為樣品液和DPPH溶液吸光度值；Ae為不含DPPH溶液時(shí)樣品液吸光度值。

(2)·OH清除率的測(cè)定

采用水楊酸比色法測(cè)定羥基自由基去除率[22-23]。取不同濃度梯度樣品1.00 mL,加入2.00 mL FeSO4,1.50 mL水楊酸,再加入0.10 mL H2O2,搖勻,置于暗處30min。蒸餾水為參比,在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定吸光度值?！H清除率計(jì)算公式如下:

式中:A0為生成的羥基自由基溶液吸光度值；A1為樣品液和生成羥基自由基溶液吸光度值；A2為樣品液吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

由圖1可知,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為:A=9.3857C+0.004 4,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8,表明二者線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids from Noni

由圖2可知,黃酮提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)增加后減少的趨勢(shì)。乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),提取率最大。推測(cè)其原因可能是水的加入使樣品充分溶脹,使樣品和溶劑的接觸面積增加,導(dǎo)致了黃酮的提取率也增加。因此,選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

2.2.2 液料比對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響

圖3 液料比對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of flavonoids from Noni

由圖3可知,黃酮提取率隨液料比的增大呈現(xiàn)增加后減少的趨勢(shì)。液料比為50∶1(mL∶g)時(shí)提取率最大。因此,選擇液料比為50∶1(mL∶g)。

2.2.3 微波提取時(shí)間對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響

圖4 微波輔助提取時(shí)間對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of microwave-assisted extraction time on the extraction rate of flavonoids from Noni

由圖4可知,黃酮提取率隨微波提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增加后減少的趨勢(shì)。微波提取時(shí)間為3min時(shí),提取率最大。由于微波時(shí)間較長(zhǎng)時(shí),乙醇被蒸干情況嚴(yán)重,導(dǎo)致提取率下降。因此,選擇微波時(shí)間為3 min。

2.2.4 微波功率對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響

圖5 微波功率對(duì)諾麗果黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of microwave power on extraction rate of flavonoids from Noni

由圖5可知,黃酮提取率隨微波提取功率的增大呈現(xiàn)增加后減少的趨勢(shì)。微波提取功率為300 W時(shí),提取率最大。推測(cè)是由于提取溫度隨著提取功率的增大而升高乙醇揮發(fā)的越快,從而影響試驗(yàn)效果。因此,選擇微波功率為300 W。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表2 諾麗果黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments for extraction process optimization of flavonoids from Noni

續(xù)表

2.3.2 模型的建立及方差分析

用Design-Expert8.0.6軟件將模型進(jìn)行分析,得到諾麗果中黃酮提取率以及所選4個(gè)因素編碼值的回歸方程為:

顯著性檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 多元回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of multiple regression model

續(xù)表

由表3可知,失擬項(xiàng)P=0.221 3,說(shuō)明相對(duì)于純誤差失擬不顯著(P＞0.05)。模型P=0.000 1說(shuō)明模型極顯著。獲得模型線性回歸系數(shù)R2=0.9169,說(shuō)明91.69%響應(yīng)值的變化是由獨(dú)立變量決定,只有8.31%的總變異系數(shù)不能由該模型來(lái)解釋。此外,模型的變異系數(shù)(coefficient of variation,CV)相對(duì)較低(6.27%),證明該試驗(yàn)值有較高的精密度及可靠性。綜上所述,該模型擬合度符合數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)原則,諾麗果中黃酮提取的最佳工藝可以用此方程預(yù)測(cè)。根據(jù)F值的大小,得出黃酮成分提取率受各因素的影響次序:微波功率(D)＞液料比(B)＞乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)＞微波提取時(shí)間(C)。

2.3.3 響應(yīng)面分析

參照王燕等[24-26]的方法,用Design-Expert8.0.6軟件繪制以黃酮提取率為響應(yīng)值的各因子的響應(yīng)曲面圖,并研究其交互作用,發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間、液料比和提取時(shí)間三組交互作用相對(duì)較弱；而乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率、提取時(shí)間和微波功率、液料比和微波功率三組交互作用較強(qiáng),具體如圖5所示。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、液料比與微波功率交互作用對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)曲面與等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between ethanol concentration,extraction time,liquid-solid ratio and microwave power on flavonoids extraction rate

由圖5可知,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大提取率也增大,且在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)提取率最大,超過(guò)50%后開(kāi)始下降,微波功率呈先上升后下降的趨勢(shì)。由其等高線圖可以看出,等高線呈橢圓形,說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與微波功率的交互影響較為顯著。隨著提取時(shí)間的增加,提取率也呈增加趨勢(shì),且在3 min處達(dá)到最高值,而后逐漸下降,提取時(shí)間與微波功率對(duì)提取率的影響較大,表現(xiàn)為曲線較為陡峭。由等高線圖可知,等高線呈橢圓的趨勢(shì)顯著,說(shuō)明二者交互作用影響較為顯著。液料比的影響趨勢(shì)也相似,隨著液料比的增大,提取率升高,在50∶1(mL∶g)處達(dá)到最高值,而后提取率開(kāi)始降低,液料比與微波功率對(duì)諾麗果提取率的影響相對(duì)最大,表現(xiàn)為曲線更為陡峭。由等高線圖可以看出,等高線為更扁的橢圓形,說(shuō)明微波功率與液料比對(duì)諾麗果黃酮提取率交互作用相當(dāng)顯著。綜合分析發(fā)現(xiàn),液料比與微波功率的交互作用最為顯著。

2.4 最優(yōu)工藝及驗(yàn)證試驗(yàn)

對(duì)多元二次方程進(jìn)行求解和分析,得出微波輔助法提取諾麗果中黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,微波輔助提取時(shí)間3min,溶劑和諾麗果的液料比50∶1(mL∶g),微波功率300 W,模型預(yù)測(cè)黃酮提取率為26.204 mg/g。檢驗(yàn)優(yōu)化模擬結(jié)果,確定最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、微波提取時(shí)間3 min、液料比50∶1(mL∶g)、微波功率300 W,做5次平行樣,計(jì)算平均值為25.981 mg/g,與模型預(yù)測(cè)值基本一致,說(shuō)明所得模型可以用來(lái)預(yù)測(cè)諾麗果中黃酮提取率。

2.5 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)試驗(yàn)得出,諾麗果黃酮提取液質(zhì)量濃度為8.00mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基、·OH去除能力達(dá)到最大,分別為92.8%、82.8%,說(shuō)明諾麗果提取物對(duì)DPPH自由基及·OH具備較好的去除能力。

3 結(jié)論

經(jīng)Design-Expert8.0.6優(yōu)化,檢驗(yàn)確定最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%,微波輔助提取時(shí)間3 min,液料比50∶1(mL∶g),微波功率300 W,在此條件下,黃酮提取率平均值為25.981 mg/g。

諾麗果黃酮提取液質(zhì)量濃度為8.00mg/mL時(shí)對(duì)DPPH自由基、·OH去除能力達(dá)到最大,分別為92.8%、82.8%,說(shuō)明其抗氧化能力較強(qiáng)。

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