應(yīng)用植入遙測技術(shù)對恒河猴部分生理指標的觀測

盧祺炯，陳敏華，徐 聰，鄧 軍，徐志偉，宣堯仙

(長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心藥物安全性評價團隊，浙江省醫(yī)學科學院安全性評價研究中心，杭州 310053)

國家食品藥品監(jiān)督管理總局2014年發(fā)布的《藥物安全藥理學研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[1]與ICH發(fā)布的《Safety Pharmacology Studies for Human Pharmaceuticals》[2]，均建議采用清醒動物進行實驗。應(yīng)用遙測技術(shù)，可以長時間不間斷獲取清醒無束縛動物的呼吸、血壓、心電和體溫等核心數(shù)據(jù)，實驗方法不僅符合各類指導(dǎo)原則的要求，而且獲取的數(shù)據(jù)更加真實可信。但因動物自身存在著晝夜差異與應(yīng)激變化，在需要長時間連續(xù)觀察的實驗場合，無法避免上述影響因素的干擾，所以了解動物生理信號的晝夜變化規(guī)律和對應(yīng)激因素的反應(yīng)程度，是合理設(shè)計實驗方案、客觀分析實驗結(jié)果所必須的。近年來已有許多國內(nèi)外學者對恒河猴的生理數(shù)據(jù)的自身規(guī)律做了一定的研究，齊衛(wèi)紅[3]、仉懷林[4]等觀察了猴的心電、血壓的周期性和應(yīng)激變化，Kaiser等[5]觀察了猴的生活環(huán)境對生理信號的影響，但上述研究或者是在麻醉、束縛狀態(tài)下進行，或者應(yīng)用了遙測系統(tǒng)但觀察指標數(shù)量少，范圍窄，不能作為GLP條件下的安全藥理學研究的參考數(shù)據(jù)。作者用恒河猴建立應(yīng)用植入遙測技術(shù)的動物模型，獲取了恒河猴清醒無束縛狀態(tài)下24 h的呼吸、血壓、心電和體溫等指標，了解了恒河猴核心生理指標的晝夜節(jié)律以及部分應(yīng)激條件下的變化情況，為今后恒河猴在藥理毒理學中的應(yīng)用提供可靠的參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

恒河猴，普通級，年齡3～5歲，體重3.1～6.5 kg，8只，雌雄各半，由寧波市鄞州東吳天童獼猴養(yǎng)殖場提供 [SCXK (浙) 2013-0027]，動物質(zhì)量合格證號：0002570。飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學科學院安全性評價研究中心普通級猴飼養(yǎng)室中，溫度16℃～26℃，相對濕度40%～70%，中央空調(diào)集中通風每小時8～10次，光照12 h明、12 h暗 [SYXK (浙) 2012-0176]。喂飼猴全價顆粒營養(yǎng)飼料，LAWS-2000實驗動物反滲透純水機處理的飲水。經(jīng)IACUC批準動物使用申請書編號：GLP-A-033。

1.2 主要試劑與儀器

注射用頭孢西丁鈉(2 g)，獸用復(fù)方氨基比林注射液，戊巴比妥鈉，異氟烷。DSI電生理遙測系統(tǒng)，植入子型號TL11M3-D70-PCTR，美國DSI公司；Matrix動物麻醉機，美國Midmark公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型的建立

(1)術(shù)前準備：猴下肢建立靜脈通道靜注戊巴比妥鈉溶液(3%，1 mL/kg)誘導(dǎo)麻醉后備皮，手術(shù)臺恒溫37℃，麻醉機維持麻醉后靜脈滴注注射用頭孢西丁鈉，每只猴0.5 g，3 mL/min。開啟遙測系統(tǒng)主機與植入子電源，監(jiān)測植入子信號，植入子浸泡于0.9% NaCl注射液20 min以上。

(2)植入手術(shù)：沿術(shù)側(cè)股動脈搏動最明顯位置縱向切開皮膚(切口1，見圖1)，切口長度3～4 cm。鈍性分離皮下組織和肌肉層，暴露并分離股動脈后，沿股動脈下方穿三根非吸收線備用，蓋上浸潤0.9% NaCl注射液的無菌紗布預(yù)防切口干燥。術(shù)側(cè)腹斜肌位置，以臍部橫向延伸線為中點，切開6～7 cm皮膚，分離皮下組織，分離腹斜肌5～6 cm并擴張成一大小合適的“口袋”供植入子主體放入，在已分離的腹斜肌層靠近股動脈側(cè)穿孔引出壓力導(dǎo)后沿皮下穿至切口1，將植入子放入已分離的腹斜肌層內(nèi)，電極導(dǎo)線自分離處引出備用。結(jié)扎已分離股動脈遠心端，動脈夾夾住近心端，開口后插入壓力導(dǎo)管到達腹主動脈橫膈膜上方，導(dǎo)管到位后用預(yù)留的非吸收線結(jié)扎并固定，遙測系統(tǒng)觀察確認檢測到血壓并且正常后，分層縫合切口1組織和皮膚。

(3)切口3、4、5位置的確定：沿著動物側(cè)面的腋窩褶皺向尾部延伸至第7肋骨處為中點，在動物身體雙側(cè)對稱位置各作約4 cm的縱向切口，即切口3、4。切口5位于動物右胸鎖骨正中下方，橫向，長約2 cm，放置ECG負極。所有負極放在動物右側(cè)，所有正極放在左側(cè)，綠色參考電極固定在植入子本體處(切口2)。見圖1。

圖1 手術(shù)區(qū)域示意圖Fig.1 Diagram of operation regions

(4)電極導(dǎo)線穿引順序：先將所有心電、呼吸電極導(dǎo)線從切口2穿引至切口3。再將ECG負極和呼吸測量負極從切口3穿引至切口4，其余留在切口3處。最后將ECG負極由切口4穿引至切口5。所有電極頭部剝?nèi)ミm量導(dǎo)線外皮制作電極環(huán)。

(5)呼吸電極的埋植：鈍性分離切口3、4的胸腔肌肉形成小的“口袋”，可將環(huán)狀的電極平放在肌肉下的“口袋”中。紫色電極朝頭部方向，藍色電極朝尾部方向，暫不縫合固定。隨后打開Ponemah軟件監(jiān)測下微調(diào)電極距離至呼吸電阻信號50～70 Ω之間，非吸收線縫合固定。之后分層縫合3、4、5切口。

(6)將植入子本體和切口2用生理鹽水沖洗干凈。整理電極導(dǎo)線一并放入肌肉下“口袋”內(nèi)，分層縫合切口2肌肉層、皮下組織和皮膚。每個切口縫合前預(yù)先用抗生素溶液沖洗腔體，完成縫合后即碘伏消毒。待頭孢西丁鈉注射液滴注完畢后，拔去留置針。解除動物固定，肌注復(fù)方氨基比林注射液，停止吸入麻醉，立即將動物轉(zhuǎn)移至動物籠中觀察動物狀態(tài)至清醒。

1.3.2 術(shù)后護理

術(shù)后次日注射復(fù)方氨基比林注射液1次，連續(xù)3 d肌注青霉素，碘伏消毒切口5 d后拆線。定期觀察傷口恢復(fù)情況，防止動物撕咬或抓撓傷口將導(dǎo)管、導(dǎo)線或主體拉出。傷口如出現(xiàn)血清腫，用注射器抽取皮下積液。恢復(fù)期3周后進行實驗。

1.3.3 數(shù)據(jù)采集與分析

連續(xù)觀察分析24 h猴的II導(dǎo)心電圖、呼吸、血壓，并用Ponemah分析軟件進行各指標分析，同時比較猴晝夜生理指標的變化。觀察期間設(shè)定上午9:00、下午14:00時間段實驗室工作人員進入猴房清洗、喂食。

1.3.4 觀察指標

猴心電指標：心率(HR)、P波幅度(P-A)、PR間期(PR-I)、R波幅度(R-A)、QRS時程(QRS)、ST位移(STE)、T波幅度(T-A)、QT間期(QT-I)、校正QT間期(QTcb)；猴呼吸指標：呼吸頻率(BPM)、分鐘通氣量(MV)、潮氣量(TV)；血壓指標：收縮壓(SYS)、舒張壓(DIA)、平均動脈壓(MAP)；體溫。以及上述指標的白晝均值、夜晚均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

經(jīng)數(shù)據(jù)分析、整理與統(tǒng)計，下列表1、表2、表3所示數(shù)據(jù)為本次研究獲取的恒河猴呼吸、血壓、心電、體溫的24 h連續(xù)檢測結(jié)果。表4為本次研究獲取的恒河猴各項生理指標的白晝、黑夜與全天均值。

2.1 恒河猴24 h呼吸、體溫分析

根據(jù)表1、表3、表4可知，恒河猴的潮氣量(TV)、分鐘通氣量(MV)、呼吸頻率(RR)、體溫的白晝均值明顯高于夜晚(P< 0.01)，其中TV均值白晝?yōu)?64.5±20.9) mL，夜晚為(36.6±17.0) mL；MV均值白晝?yōu)?1931.9±887.2) mL/min，夜晚為(920.1±527.5) mL/min；RR均值白晝?yōu)槊糠昼?32.3±5.7)次，夜晚為每分鐘(25.4±4.3)次；體溫白晝均值為(38.0±0.4) ℃，夜晚為(36.9±0.3) ℃。上午9:00為呼吸、體溫的峰值時段，夜晚的22:00為TV和MV的最低點，夜晚0:00為RR的最低點，1:00為體溫的最低點。自17:00起，猴的呼吸和體溫的四項參數(shù)值均開始下降，至19:00趨于平穩(wěn)。猴的呼吸和體溫指標中，TV、MV的晝夜變異系數(shù)均> 10%，RR和體溫的晝夜變異系數(shù)均< 10%。

表1 恒河猴24 h各項呼吸指標列表

表2 恒河猴24 h各項心電指標列表

表3 恒河猴24 h體溫和血壓生理指標列表

表4 恒河猴24 h呼吸、心電、體溫、血壓各指標分析結(jié)果

注：與白晝比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with daytime,*P< 0.05,**P< 0.01.

2.2 恒河猴24 h心電分析

根據(jù)表1～4可知，恒河猴的心律(HR)、呼吸頻率間期(RR-I)、T波幅度(T-A)、PR間期(PR-I)、QT間期(QT-I)、校正QT間期(QTcb)等心電指標存在晝夜差異，且差異有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)，R波幅度(R-A)、P波幅度(P-A)、ST位移(STE)、QRS時程(QRS)等心電指標無的晝夜差異無顯著性(P> 0.05)。差異有顯著性的各項心電指標中，HR白晝均值為每分鐘(155.0±29.6)次，黑夜為每分鐘(122.4±32.1)次；RR-I白晝?yōu)?410.8±77.4) ms，黑夜為(535.7±130.6) ms；T-A白晝?yōu)?0.181±0.046) mV，黑夜為(0.157±0.071) mV；PR-I白晝?yōu)?80.4±8.4) ms，黑夜為(87.4±9.9) ms；QT-I白晝?yōu)?224.8±21.6) ms、黑夜為(263.9±17.9) ms；QTcb白晝?yōu)?352.3±18.0) ms，黑夜為(366.7±23.1) ms。恒河猴24 h心電指標中，峰值或谷值出現(xiàn)在上午9:00的有RR-I、HR、QRS、PR-I、R-A、QT-I和QTcb等指標，P-A的峰值出現(xiàn)在1:00，T-A和STE峰值分別出現(xiàn)在17:00和1:00。RR-I、HR、T-A、PR-I、QT-I、QTCb等晝夜差異有顯著性的心電指標中，均可見17:00～19:00時間段有著穩(wěn)定且幅度較大的變化。ECG各指標中P-A、T-A夜晚的變異系數(shù)> 10%，STE晝夜變異系數(shù)均> 10%，其余指標均< 10%。

2.3 恒河猴24 h動態(tài)血壓分析

根據(jù)表3、表4可知，恒河猴的收縮壓(SYS)、舒張壓(DIA)、平均動脈壓(MAP)白晝均值明顯高于夜晚(P< 0.01)，其中SYS均值白晝?yōu)?144.6±20.1) mmHg、夜晚為(131.6±18.9) mmHg，DIA均值白晝?yōu)?99.8±12.0) mmHg、夜晚為(89.9±12.5) mmHg，MAP均值白晝?yōu)?121.5±15.1) mmHg、夜晚為(110.2±14.9) mmHg。猴的SYS、DIA、MAP的峰值均出現(xiàn)在上午9:00，自17:00起猴的血壓指標均逐漸下降，至19:00趨于平穩(wěn)，三個血壓指標的晝夜變異系數(shù)均< 10%。

3 討論

安全性評價研究中使用的靈長類動物常用恒河猴或食蟹猴。本機構(gòu)實驗用猴年齡段一般為3～5歲，體重因種屬、性別、體型的不同，食蟹猴一般使用3～5 kg，恒河猴為3～7 kg。

遙測系統(tǒng)植入子的植入手術(shù)操作造成的創(chuàng)口多，并且動物的依從性較差，一旦植入失敗或者植入子導(dǎo)線因為傷口裂開被動物撕咬破壞會造成較大的損失，所以此類手術(shù)對成功率的要求是非常高的，所以手術(shù)中縫合技術(shù)和術(shù)后護理方案的選擇是在整個實驗流程中非常重要的一環(huán)，梁春南[6]曾報道過一例植入手術(shù)后創(chuàng)口開裂無法愈合，所以作者對不同層次的組織分別選用以下方法：肌肉層使用8字縫合法，皮下組織連續(xù)縫合，皮膚層皮內(nèi)連續(xù)縫合法，縫合前一律用抗生素溶液清洗浸潤創(chuàng)口。術(shù)后每日檢視傷口恢復(fù)狀況，發(fā)現(xiàn)傷口愈合良好，沒有出現(xiàn)傷口開裂，抓撓或撕咬傷口拉扯埋置導(dǎo)線的情況。

在實驗前期，因作者低估了猴的破壞能力，在使用全不銹鋼半封閉猴籠(側(cè)面封閉、正面鋼管門、上下方與后方為鋼管與不銹鋼網(wǎng))的條件下，植入子接收器導(dǎo)線因為布線不合理，在術(shù)后恢復(fù)期間被猴拉入籠內(nèi)并咬斷2根，修復(fù)導(dǎo)線之后作者重新調(diào)整了接收器的固定位置和導(dǎo)線的布線，避開猴肢體可能接觸到的位置，才避免了猴對實驗設(shè)施的繼續(xù)破壞。

實驗結(jié)果表明，在實驗人員活動集中的時間段(上午9:00)，出入動物房進行清掃、喂食、加飲水等此類非直接接觸動物的行為，對恒河猴的呼吸、血壓、心電和體溫有著一定的應(yīng)激影響，猴目視實驗人員后在籠內(nèi)跳躍、快速行走，待實驗人員結(jié)束動物房內(nèi)的操作離開后，猴會很快安靜下來，從實驗結(jié)果可見上午10:00時間段的各指標基本恢復(fù)至上午8:00的水平。但下午14:00時間段實驗人員進行第二次清掃、喂食、加飲水操作時，猴的應(yīng)激反應(yīng)不再像上午9:00時間段那樣激烈，基本上都比較安靜，猴的呼吸、血壓、心電、體溫等指標的變化幅度也未見大范圍的波動。筆者認為9:00時間段出現(xiàn)的應(yīng)激變化比較明顯的原因，是上午喂食之前猴基本都空腹12 h左右，饑餓感比較強，猴經(jīng)過一段時間的馴養(yǎng)，已了解上午工作人員出現(xiàn)的時候就是喂食時間，所以更容易興奮導(dǎo)致的。而下午14:00時間段操作時，猴的進食意愿就不如上午強烈，應(yīng)激反應(yīng)較小。

實驗結(jié)果還表明，猴的生理指標存在明顯的晝夜差異，其潮氣量、分鐘通氣量、呼吸頻率、收縮壓、舒張壓、平均動脈壓、心率、T波幅度、體溫均為白天(8:00～16:00)明顯高于夜晚(20:00～4:00)，PR間期、呼吸頻率間期、QT間期、校正QT間期則相應(yīng)地表現(xiàn)為白天明顯低于夜晚。而R波幅度、P波幅度、ST位移、QRS時程這四個指標則未顯示晝夜差異。從上述實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，呼吸、血壓、體溫的晝夜差異存在著一致性和相關(guān)性，但心電的時間指標中RR間期、PR間期、QT間期、校正QT間期等四項有晝夜差異，而QRS時程則無晝夜差異，電壓指標中僅T波幅度顯示有晝夜差異，R波幅度、P波幅度、ST位移則未顯示晝夜差異。本實驗結(jié)果中計算的變異系數(shù)(CV)，以≥ 10%為界，認為在統(tǒng)計學意義上的變化無參考意義，其中晝夜波動幅度均≥ 10%的有潮氣量、分鐘通氣量和STE三項指標，另P波幅度、T波幅度的夜晚CV ≥ 10%，其余指標的晝夜CV均< 10%。根據(jù)實驗結(jié)果，因猴的呼吸、血壓、心電、體溫等生理指標存在晝夜節(jié)律，所以在實驗設(shè)計時應(yīng)當充分考慮此因素，在給藥和觀察時間段應(yīng)按已獲取的基線結(jié)果設(shè)計，例如給藥和觀察時間較短，并且在白晝給藥的，應(yīng)把實驗時間安排在7:00～16:00內(nèi)。如發(fā)現(xiàn)猴對工作人員的應(yīng)激反應(yīng)比較劇烈，應(yīng)記錄此類應(yīng)激反應(yīng)特點和時間，此時間段的實驗數(shù)據(jù)在后期分析時也應(yīng)有合適的解釋。在對獲取的呼吸指標進行統(tǒng)計分析時，應(yīng)綜合其他因素判斷受試物對呼吸指標的影響，而不是簡單地參照統(tǒng)計學意義的結(jié)果進行判斷?？偠灾趹?yīng)用無創(chuàng)遙測系統(tǒng)進行安全藥理學研究時，應(yīng)當在正式實驗之前，盡量考慮到所有對猴的各種應(yīng)激因素[4]，獲取完善的基線(baseline)數(shù)據(jù)，并對應(yīng)正式實驗操作的特點，在記錄動物baseline數(shù)據(jù)的時候安排合適的應(yīng)激因素(可以人工模擬)，包括喂食、巡視、清掃、短時間固定、給藥等，為該批次動物進行的實驗提供正確的參考依據(jù)。

本文應(yīng)用植入遙測技術(shù)觀察到的恒河猴呼吸、血壓、心電、體溫等生理指標基本上均有明顯的晝夜節(jié)律變化，呼吸、血壓、心電、體溫等指標白晝均高于夜晚，符合正常恒河猴的生理周期特性。經(jīng)過馴養(yǎng)的恒河猴在饑餓狀態(tài)下對工作人員的喂食清掃活動的應(yīng)激影響比較強烈。應(yīng)用植入遙測技術(shù)可以對清醒無束縛狀態(tài)下恒河猴心電、血壓、呼吸、體溫等進行連續(xù)監(jiān)測，能真實地反映恒河猴24 h內(nèi)上述生理指標的變化規(guī)律，為恒河猴在藥理毒理學研究中的應(yīng)用提供參考。同時應(yīng)用植入遙測技術(shù)，有助于提高藥物安全藥理學研究的效率，減少動物的使用數(shù)量，符合3R原則。

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