大鼠門靜脈高壓對血清內(nèi)毒素及腸黏膜的影響分析

李曉娟，張巧云，馮 帆，姜棋予，柴燕濤，李 潤，侯 俊*，李瑞生*

(1.解放軍第302醫(yī)院臨床研究管理中心，北京 100039； 2.山東省蓬萊市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 蓬萊 265600)

門脈高壓和內(nèi)毒素血癥是肝硬化晚期最常見的并發(fā)癥[1]。內(nèi)毒素(endotoxin，ET)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖，可通過多種途徑介導(dǎo)機(jī)體損傷[2]。當(dāng)肝硬化形成時(shí)，肝內(nèi)組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變導(dǎo)致肝臟枯否細(xì)胞對內(nèi)毒素的清除下降。同時(shí)門脈高壓形成后致側(cè)枝循環(huán)開放，也使內(nèi)毒素在肝內(nèi)的清除下降，上述這兩種原因均導(dǎo)致內(nèi)毒素可以繞過肝臟直接進(jìn)入體循環(huán)[3]。目前研究表明腸道除了具有消化吸收功能之外，還具有內(nèi)分泌、免疫和屏障功能，而肝功能正常與否與腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生密切相關(guān)[4]，尤其肝腸相互作用軸已成為目前研究的熱點(diǎn)，假設(shè)腸粘膜屏障功能障礙，會(huì)加重腸道微生態(tài)平衡的破壞及機(jī)體免疫功能的損害[5-6]。因此本實(shí)驗(yàn)利用SD大鼠構(gòu)建肝臟功能正?；A(chǔ)上的單純性門脈高壓模型，分別取不同時(shí)間點(diǎn)檢測血清內(nèi)毒素的變化以及腸道病理的變化，旨在分析在單純性門脈高壓的情況下，內(nèi)毒素和腸道通透性的變化情況，以期為肝硬化腸肝互作的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物選擇軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級SD大鼠16只，雄性，單鼠體質(zhì)量190～200 g [SCXK (軍) 2012-004]。飼養(yǎng)室溫度22℃～23℃，環(huán)境濕度50%，自由進(jìn)食和飲水 [SYXK (軍) 2012-010]。

1.2 主要試劑與儀器

大鼠內(nèi)毒素ELISA試劑盒(科晶生物，KJ-1908)；水合氯醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20151023)。顯微外科手術(shù)器械；K10CD型干浴恒溫箱(杭州奧盛儀器有限公司)；TD型電子天平(余姚市金諾天平有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備

實(shí)驗(yàn)分別取4只大鼠作為空白對照組，12只大鼠作為門脈部分結(jié)扎模型組。模型構(gòu)建：在無菌條件下，使用水合氯醛(濃度為10%)進(jìn)行麻醉，注射劑量為每只0.7 mL，待大鼠進(jìn)入深麻醉狀態(tài)，作劍突下正中切口2.0～3.0 cm，將肝臟輕輕向上翻起，將胃腸輕輕向右撥開，放置于生理鹽水浸潤的紗布上可以清晰的看到門靜脈的位置。鈍性分離門靜脈，在門靜脈外緣平行放置2根外徑為0.8 mm的平頭空心管，用4/0絲線結(jié)扎門靜脈主干和與之并行的鈍性針頭，結(jié)扎完后，輕輕拔出平頭空心管，關(guān)腹。對照組作假手術(shù)僅游離門靜脈，臟器復(fù)位后分層關(guān)腹。實(shí)驗(yàn)過程中均遵循3R原則，對動(dòng)物實(shí)施人道主義關(guān)懷。

1.3.2 內(nèi)毒素測定

首先通過大鼠眶后靜脈叢采集空白對照組大鼠血液，隨后分別在3 d、7 d、10 d采集模型組大鼠血液，室溫靜置30 min，離心取血清，用ELISA法檢測血清中內(nèi)毒素的結(jié)果，每個(gè)樣本均進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測。所有實(shí)驗(yàn)器材均采用去熱原處理。

1.3.3 腸道病理檢查

空白對照組在首次采集完血液后，模型組分別在3 d、7 d、10 d采集血液后，處死大鼠，分別采集空腸、回腸、結(jié)腸。用4%甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和HE染色，光學(xué)顯微鏡下行病理組織形態(tài)學(xué)觀察[7]，根據(jù)病理切片結(jié)果對不同部位腸黏膜的變化過程進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠門脈部分結(jié)扎模型構(gòu)建及一般狀態(tài)

12只模型組大鼠均成功分離出門靜脈，并進(jìn)行門靜脈部分結(jié)扎手術(shù)(見圖1)。術(shù)后大鼠一般狀況均良好，飲食正常，隨著時(shí)間的推移也未出現(xiàn)各種不適以及精神萎靡的狀況。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠內(nèi)毒素的變化

空白對照組和模型組(3 d、7 d、10 d)每只大鼠的樣本均進(jìn)行3孔重復(fù)，得出每個(gè)樣本的內(nèi)毒素均數(shù)。然后各組相互之間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，各模型組血清內(nèi)毒素的結(jié)果與正常對照組之間差異無顯著性(見表1)。

注：A：麻醉剖腹探查門靜脈；B：鈍性分離門靜脈；C：部分結(jié)扎門靜脈。圖1 大鼠門脈部分結(jié)扎模型Note. A: Exploration of the portal vein by laparotomy after anesthesia. B: Blunt separation of the portal vein. C: Partial ligation of the portal vein.Fig.1 Partial portal vein ligation in a rat

組別Groups正常組Normalgroup模型組(3d)Modelgroup(3d)模型組(7d)Modelgroup(7d)模型組(10d)Modelgroup(10d)內(nèi)毒素含量Endotoxinlevels5114±2624319±8054364±5294160±764

注：箭頭所指為黏膜脫落部位。圖2 大鼠不同時(shí)間點(diǎn)空、回、結(jié)腸病理學(xué)結(jié)果(HE染色，× 10)Note. Arrows indicate the abscission sites of epithelial cells in the intestinal mucosa.Fig.2 Histopathological changes of the jejunum, ileum and colon at different time points in the rats of different groups. HE staining

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腸道病理組織學(xué)結(jié)果

病理組織學(xué)觀察結(jié)果表明：空白對照組大鼠空腸、回腸和結(jié)腸的病理組織結(jié)構(gòu)整齊，粘膜分層規(guī)則清晰，各層結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞與固有層間連結(jié)緊密無縫隙；成模3 d后各腸段的粘膜層次依然較整齊清晰，上皮與固有層的連接還未出現(xiàn)縫隙；而成模7 d后各腸段較3 d粘膜層的局部腸絨毛出現(xiàn)了部分破壞和腫脹，上皮細(xì)胞與固有層間連結(jié)出現(xiàn)了松散的狀況；成模10 d較3 d和7 d的腸黏膜發(fā)生了較大的損傷：腸絨毛排列凌亂，部分腫脹溶解，粘膜上皮細(xì)胞可見萎縮脫落。黏膜下炎癥細(xì)胞浸潤增多，上皮細(xì)胞與固有層的間距可見明顯增寬；而固有層腺體明顯減少及破壞。

3 討論

在正常情況下，腸黏膜屏障在保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮了重要作用，腸黏膜能夠阻止腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素向腸外移位，保護(hù)機(jī)體免受食物抗原、微生物及其有害代謝產(chǎn)物的損害[8]。而當(dāng)肝硬化尤其是出現(xiàn)門脈高壓合并腹水時(shí)，腸黏膜屏障系統(tǒng)也會(huì)隨之發(fā)生功能改變。徐義軍等[9]發(fā)現(xiàn)當(dāng)腸道通透性顯著增加后，早期即可出現(xiàn)細(xì)菌移位并形成內(nèi)毒素血癥。施琳琳等[10]也驗(yàn)證了應(yīng)用中藥大黃可以改善由于肝硬化導(dǎo)致內(nèi)毒素滅活減少，腸免疫功能紊亂而導(dǎo)致的腸道菌群異常增生和腸源性內(nèi)毒素吸收增加形成的腸源性內(nèi)毒素血癥。而在肝功能正常狀態(tài)下形成門脈高壓以觀察內(nèi)毒素和腸黏膜改變的研究尚未報(bào)道。

因此本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SD大鼠構(gòu)建肝臟功能正常的單純性門脈高壓模型，分別取不同時(shí)間點(diǎn)檢測血清內(nèi)毒素的變化情況以及胃腸道病理變化情況，結(jié)果顯示，模型組大鼠均成功構(gòu)建了門脈部分結(jié)扎模型。術(shù)后大鼠一般狀況均良好，飲食正常，隨著時(shí)間的推移也未出現(xiàn)各種不適以及精神萎靡的狀況。此法與王繼見等[11]使用Wistar大鼠構(gòu)建門脈部分結(jié)扎模型相似，此法操作簡便、快速，成模時(shí)間短，且能對門靜脈部分結(jié)扎后到形成門脈高壓期間檢測的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。本實(shí)驗(yàn)對不同時(shí)間點(diǎn)的血清內(nèi)毒素進(jìn)行檢測結(jié)果顯示，不同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)毒素差異無顯著性。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，肝臟作為體內(nèi)清除內(nèi)毒素和解毒的主要臟器，是遭受內(nèi)毒素攻擊的首要器官。而在正常情況下，肝臟具有很強(qiáng)的內(nèi)毒素滅活能力，由此看出，肝臟正常時(shí)可以將來自門靜脈的內(nèi)毒素完全滅活，因而不會(huì)發(fā)生內(nèi)毒素血癥。若肝臟受損如肝硬化時(shí)，對內(nèi)毒素的滅活能力下降，則容易發(fā)生腸源性內(nèi)毒素血癥[12]。因此推斷在本實(shí)驗(yàn)的操作過程中，由于肝臟功能未受損，內(nèi)毒素的升高還未超出肝臟處理內(nèi)毒素的上限，因此內(nèi)毒素未出現(xiàn)很大的波動(dòng)。但是不同部位腸段的病理結(jié)果顯示，成模3 d后各腸段也未發(fā)生很大的損傷，成模7 d后各腸段局部腸絨毛出現(xiàn)了部分破壞和腫脹，上皮細(xì)胞與固有層間連結(jié)出現(xiàn)了松散的狀況；成模10 d較3 d和7 d腸段均出現(xiàn)了明顯的損傷。腸粘膜屏障是由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障以及免疫屏障共同構(gòu)成。在腸粘膜機(jī)械屏障組成成分中，腸上皮細(xì)胞及其緊密連接是最重要的組成部分[13-14]。因此本實(shí)驗(yàn)單純門脈高壓可以造成腸黏膜出現(xiàn)損傷，如果繼續(xù)發(fā)展將會(huì)使進(jìn)入門靜脈的內(nèi)毒素不斷增加，最終如果超出了肝臟的清理能力，就可能會(huì)逆流入血形成內(nèi)毒素血癥，這一點(diǎn)有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過單純制造門脈高壓模型檢測內(nèi)毒素和腸黏膜變化情況發(fā)現(xiàn)，在短時(shí)間內(nèi)，在肝功能正常的情況下，門脈高壓可以造成腸黏膜的損傷，而腸道產(chǎn)生的內(nèi)毒素不會(huì)很快超出肝臟的處理能力而出現(xiàn)血清內(nèi)毒素升高的現(xiàn)象，為今后研究肝硬化門脈高壓與內(nèi)毒素血癥和腸黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

[1] 陸苗青, 余菲, 許東. 內(nèi)毒素在肝衰竭發(fā)生中的作用研究進(jìn)展 [J]. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志, 2015, 25(4): 252-256.

[2] Sawhney R, Jalan R. Liver. The gut is a key target of therapy in hepatic encephalopathy [J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2015, 12(1): 7-8.

[3] 馬全玲, 劉揚(yáng), 李傳保, 等. 內(nèi)毒素檢測與臨床應(yīng)用現(xiàn)狀 [J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 24(2): 64-65.

[4] 周為, 陳斌, 彭杰, 等. D-半乳糖胺誘導(dǎo)肝衰竭腸源性內(nèi)毒素血癥模型最佳劑量選擇 [J]. 中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志, 2014, 24(6): 347-349.

[5] D?nulescu RM, Stanciu C, Trifan A. Assessing the risk of decompensation by ascites and spontaneous bacterial peritonitis in cirrhosis [J]. Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi, 2014, 118(2): 320-326.

[6] Wang LK, Wang LW, Li X, et al. Ethyl pyruvate prevents inflammatory factors release and decreases intestinal permeability in rats with D-galactosamine-induced acute liver failure [J]. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2013, 12(2): 180-188.

[7] 王睿林, 李曉娟, 白云峰, 等. 黃連解毒湯對小鼠酒精性脂肪肝的預(yù)防作用 [J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 25(2): 34-37, 87.

[8] 黃培寧, 鄧有輝. 微生態(tài)制劑對慢性肝衰竭患者腸道菌群、血漿內(nèi)毒素及細(xì)胞因子的影響 [J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2011, 21(18): 3798-3800.

[9] 徐義軍, 王超. 乳果糖對門脈高壓大鼠腸粘膜屏障功能保護(hù)作用的研究 [J]. 中外醫(yī)療, 2010, 29(12): 18-20.

[10] 施琳琳, 徐虹, 潘鋒, 等. 大黃素保護(hù)肝硬化門脈高壓大鼠腸屏障的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2015, 33(8): 1950-1952.

[11] 王繼見, 高根五, 劉長安, 等. 用Wistar大鼠門靜脈部分結(jié)扎制作門脈高壓動(dòng)物模型 [J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 26(3): 302-304.

[12] 李筠. 內(nèi)毒素在肝衰竭形成中的作用及中醫(yī)藥治療 [J]. 傳染病信息, 2010, 23(5): 260-262.

[13] 楊潔, 聶青和. 肝衰竭與腸道屏障功能障礙 [J]. 實(shí)用肝臟病雜志, 2010, 13(1): 66-69.

[14] 張春雨, 袁捷. 肝硬化門脈高壓動(dòng)物模型的研究進(jìn)展 [J]. 肝膽胰外科雜志, 2012, 24(2): 176-177.