腺嘌呤誘導慢性腎臟病大鼠模型的骨與礦物質(zhì)代謝異常

孟 彥，張 豪，賀 寧，石東英，李青南，趙建榮*，左 力

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，呼和浩特 010050； 2.湖北醫(yī)藥學院口腔醫(yī)學部，湖北 十堰 442000； 3.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣州 510006； 4.廣東實驗動物監(jiān)測所，廣州 510663； 5.北京大學人民醫(yī)院腎內(nèi)科，北京 100044)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是指各種原因引起的超過三個月的腎臟結(jié)構(gòu)和(或)功能異常，具有高患病率、持續(xù)存在和緩慢進展的特點。早在CKD第3期，腎臟的排磷功能就開始下降，隨后出現(xiàn)進行性加重的骨及礦物質(zhì)代謝紊亂相關并發(fā)癥。在CKD第3～5期，大多數(shù)患者會出現(xiàn)腎性骨病[1]。腎性骨病使得CKD患者的骨折發(fā)生率升高[2]，進而導致死亡率升高[3]。血管鈣化也是CKD重要的礦物質(zhì)代謝相關并發(fā)癥之一，是CKD患者心血管死亡率和全因死亡率的獨立預測因素[4]。目前將CKD時礦物質(zhì)代謝相關血清標志物的異常、腎性骨病、血管鈣化統(tǒng)稱為慢性腎臟病骨及礦物質(zhì)代謝異常(chronic kidney disease-mineral and bone disorder，CKD-MBD)[1]。

雖然CKD-MBD存在高患病率、高危害性的特點，但是目前對于CKD-MBD發(fā)病機理的了解非常有限，臨床防治手段也不足，迫切需要加強該方面的研究。目前常用的動物模型有5/6腎切除模型、腎臟電燒模型等。上述模型存在的問題是多數(shù)對腎性骨病和血管鈣化分別進行研究；進行腎性骨病研究時，很少有研究應用骨形態(tài)計量學的方法按照2009年國際腎臟病學會提出的用骨形態(tài)計量學的方法從骨轉(zhuǎn)換、礦化、骨量(turnover, mineralization, volume；TMV)三個角度[5]進行分析。本研究采用腺嘌呤誘導的腎毒性大鼠模型，在同一模型上同時觀察了CKD時的礦物質(zhì)代謝相關生化標志物的變化情況、血管鈣化情況，并從TMV角度觀察了腎性骨病的特點，擬為后續(xù)開展的CKD-MBD發(fā)病機理及干預研究提供方法指導和基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級13周齡雄性SD大鼠20只，體重(408±10) g，購自北京維通利華實驗動物有限公司 [SCXK (京) 2012-0001]。大鼠在北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部 [SYXK (京) 2013-0032]飼養(yǎng)，環(huán)境溫度(23±2) ℃，相對濕度60%～70%，光照12 h/12 h明暗交替，每籠4只飼養(yǎng)，并按照“3R”原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

腺嘌呤(源聚生物，上海)；大鼠全段甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)ELISA試劑盒(Immutopics，美國)。RM2255型切片機(Leica，德國)；SP1600型鋸片機(Leica，德國)；Bioquant-Osteo骨形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)(Bioquant，美國)；QDR-Discovery骨密度儀(Hologic，美國)；iCAP6300型等離子體發(fā)射光譜儀(Thermo，美國)；Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件(Media Cybernetics，美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物飼料成分

動物飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn) [SCXK (京) 2014-0010]，以AIN-93實驗用嚙齒動物純化飼料配方[6]為基礎調(diào)整，第一種為含有0.75%腺嘌呤的毒性飼料，第二種為不含腺嘌呤的飼料。兩種飼料其他成分一致，均含鈣1.11%，磷1.03%，酪蛋白9%。

1.3.2 動物實驗方案

1周適應性飼養(yǎng)后將大鼠隨機分為2組：①正常對照組(normal control group)，喂以不含腺嘌呤的飲食，共6周；②慢性腎臟病組(CKD group)，第1～4周喂以含有腺嘌呤的飲食，第5～6周喂以不含腺嘌呤的飲食。第2周末，靜脈采血行血清生化標志物檢測。第6周末，處死所有大鼠。留取血標本備血清生化標志物檢測。完整分離主動脈備病理學檢查和血管鈣磷含量測定。分離雙側(cè)股骨及第五腰椎，左側(cè)股骨用于骨形態(tài)計量學檢測，右側(cè)股骨和第五腰椎行骨密度(bone mineral density，BMD)檢查。

1.3.3 生化標志物檢測

血清肌酐、尿素氮、鈣、磷由Hitachi 7170S生化分析儀檢測。血清PTH檢測采用美國Immutopics公司大鼠iPTH ELISA試劑盒。

1.3.4 血管病理學檢查

截取從降主動脈起始部到腹主動脈腹腔干上緣位置部分，切成寬度為1.5～2 mm的血管環(huán)。經(jīng)過包埋等處理，行von Kossa染色、伊紅復染。用尼康E600顯微鏡相機對每一張病理切片進行拍照，用Image-Pro Plus 5.1軟件對血管照片進行定量分析。將每只大鼠的每個血管截面的鈣化面積數(shù)值相加作為分子，將每只大鼠的每個血管截面的總面積數(shù)值相加作為分母，得出每只大鼠的血管鈣化面積百分比[7]。

1.3.5 血管鈣、磷含量的測定

將從腹腔干起始位置到左右髂總動脈起始處主動脈充分干燥，稱重。將標本用1 mL純硝酸和0.1 mL純高氯酸溶解，加熱后變?yōu)榻Y(jié)晶。超純水溶解定容到2 mL后用iCAP6300型等離子體發(fā)射光譜儀測定血管鈣磷含量。

1.3.6 BMD檢測

應用QDR-Discovery型骨密度儀檢測離體骨BMD。除測量整個股骨的平均BMD外，另外選擇兩個感興趣區(qū)(region of interest，ROI)(圖1)，為近心端股骨干的皮質(zhì)骨投影區(qū)(ROI 1)和遠心端干骺端生長板上方的投影區(qū)(ROI 2)。ROI 1由皮質(zhì)骨構(gòu)成，ROI 2主要由松質(zhì)骨組成。第五腰椎也行BMD檢測。

注：ROI：感興趣區(qū)。圖1 股骨BMD檢查感興趣區(qū)Note. ROI, region of interest.Fig.1 ROIs of the femur for detection of bone mineral density (BMD)

1.3.7 骨形態(tài)計量學檢測

分別將股骨干和股骨遠心端干骺端后2/3部分投入4%多聚甲醛固定液固定，不脫鈣用甲基丙烯酸甲酯包埋。將股骨遠心端干骺端用Leica RM2255型切片機沿冠狀面切片，4 μm厚切片甲苯胺藍染色后測靜態(tài)參數(shù)，8 μm厚切片不染色用以測動態(tài)參數(shù)，由Bioquant測量系統(tǒng)完成。用Leica SP1600鋸型切片機將股骨小轉(zhuǎn)子處的股骨干切成45 μm厚的橫斷面切片，測量股骨靜態(tài)參數(shù)。所有骨組織形態(tài)學測定均基于標準化公式[8]。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 體重、生化結(jié)果及腎臟肉眼表現(xiàn)

大鼠體重正常對照組和CKD組采用連續(xù)測量的方差分析比較，P< 0.01(圖2)。第2周末和第6周末，與正常對照組比較，CKD組的血肌酐、尿素氮、血磷和血PTH水平均顯著升高，血鈣水平明顯降低(表1)。飼養(yǎng)中無大鼠死亡。肉眼見CKD組大鼠腎臟體積增大，顏色發(fā)白(圖3B)。

注：正常對照組和CKD組進行連續(xù)測量的方差分析，組間P< 0.01。圖2 大鼠體重變化曲線Note. Repeated measure analysis of variance was used. Comparison between the normal control group and the CKD group, P < 0.01.Fig.2 Curves of body weight changes of the rats in each group

2.2 血管鈣化面積百分比及鈣磷含量測定結(jié)果

第6周末，CKD組發(fā)生血管鈣化的主動脈血管變粗、彈性消失、表面部分區(qū)域顏色發(fā)黃，為鈣化區(qū)域(圖3D和3F)，鏡下見血管鈣化主要發(fā)生在中膜(圖4)。有50%的大鼠發(fā)生主動脈鈣化。與正常對照組比較，CKD組的血管鈣、磷含量及血管鈣化面積百分比均明顯升高(圖5)。

2.3 BMD檢測結(jié)果

與正常對照組比較，第6周末，CKD組各BMD檢測指標均明顯降低(圖6)。

2.4 骨形態(tài)計量學測量結(jié)果

小梁骨骨形態(tài)計量學測量結(jié)果見表2。第6周末，CKD組的骨體積/組織體積(bone volume/tissue volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb. Th)、骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb. N)較正常對照組明顯降低，CKD組的骨小梁分離度(trabecular separation，Tb. Sp)較正常對照組明顯升高。對于骨形成參數(shù)，CKD組的成骨細胞相關參數(shù)(osteoblast surface/millimeter of bone perimeter, Ob. S/BS; osteoblast number/millimeter of bone perimeter, N. Ob/BS)和骨形成率參數(shù) [bone formation rate (bone surface referent), BFR/BS; bone formation rate (bone area referent), BFR/BV; bone formation rate (tissue area referent), BFR/TV]較正常對照組明顯升高(P< 0.01)；對于骨吸收參數(shù)，CKD組的破骨細胞相關參數(shù)(osteoblast surface/millimeter of bone perimeter, Oc. S/BS; osteoblast number/millimeter of bone perimeter, N. Oc/BS)較正常對照組明顯升高。骨礦化方面，CKD組的礦化延遲時間(mineralization lag time，MLT)與正常對照組相比差異無顯著性，CKD組的礦化成沉積率(mineralization apposition rate，MAR)和類骨質(zhì)相關參數(shù)(osteoid surface/bone surface, OS/BS; osteoid volume/bone volume, OV/BV)較正常對照組明顯升高。

表1 血清生化標志物數(shù)據(jù)

注：與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A和B：分別為正常對照組和CKD組大鼠腎臟；C和D：分別為正常對照組和CKD組大鼠心臟及主動脈；E和F：分別為正常對照組和CKD組大鼠降主動脈。圖3 大鼠腎臟及主動脈Note. A and B: Kidneys of the rats in the normal control group and the CKD group, respectively. C and D: Hearts and aortas of the rats in the normal control group and the CKD group, respectively. E and F: Descending aortas of the rats in the normal control group and the CKD group, respectively.Fig.3 Gross appearance of kidneys and aortas of the rats in each group

注：A：正常對照組；B：CKD組。黑色為鈣化區(qū)域。圖4 血管病理照片(× 20)Note. A: A control rat. B: A CKD rat. The black area is calcification.Fig.4 Cross sections of the rat aortas

皮質(zhì)骨骨量相關參數(shù)見表3。與對照組比較，CKD組的皮質(zhì)骨相關參數(shù)(cortical bone area, Ct. B. Ar; cortical bone area percentage, Ct. B. Ar%)均明顯降低(P< 0.01)。CKD組大鼠皮質(zhì)骨橫截面可以見到大小不等的侵蝕小孔，正常對照組大鼠皮質(zhì)骨截面上沒有侵蝕小孔。定量測量侵蝕小孔相關參數(shù)(porosity area, Po. Ar; porosity area percentage, Po. Ar%)，CKD組較正常對照組明顯升高(P< 0.01)。

注：與正常對照組相比，* P< 0.05，** P< 0.01。圖5 血管鈣磷含量及血管鈣化面積百分比Note. Compared with the normal control group,* P < 0.05,** P< 0.01.Fig.5 Vascular calcium and phosphorus contents and percentage of vascular calcification area

分組Groups正常對照組Normalcontrolgroup慢性腎臟病組CKDgroup骨量Bonevolume骨面積/組織面積(%)BV/TV3641±6．752011±5．25??骨小梁厚度(μm)Tb．Th5325±5．874412±4．90?骨小梁分離度(μm)Tb．Sp11137±19．4022280±78．15??骨小梁數(shù)目(mm-1)Tb．N603±0．82371±0．36??骨轉(zhuǎn)換Boneturnover成骨細胞表面長度/每毫米骨周長(%)Ob．S/BS891±4．412780±4．45??成骨細胞數(shù)目/每毫米骨周長(mm-1)N．Ob/BS859±3．111761±2．30??骨形成率(骨表面長度為指示物)[μm3/(μm2·d)]BFR/BS019±0．12083±0．19??骨形成率(骨面積為指示物)(%/y)BFR/BV15236±66．0670164±177．04??骨形成率(組織面積為指示物)(%/y)BFR/TV044±0．24110±0．32??破骨細胞表面長度/每毫米骨周長(%)Oc．S/BS633±1．981274±5．04??破骨細胞數(shù)目/每毫米骨周長(mm-1)N．Oc/BS200±0．91389±1．57?骨礦化Bonemineralization礦化延遲時間(d)MLT197±0．86192±0．43 礦化沉積率(μm/d)MAR228±0．30311±0．29??類骨質(zhì)表面長度/骨表面長度(%)OS/BS404±1．831461±6．65??類骨質(zhì)面積/骨面積(%)OV/BV059±0．33230±0．96??

注：與正常對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表3 皮質(zhì)骨骨形態(tài)計量學測量結(jié)果

注：與正常對照組比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the normal control group,**P< 0.01.

3 討論

目前動物實驗大多采用天然原料來源的配合飼料，缺點是各種主要營養(yǎng)素含量不穩(wěn)定，一定程度造成不同實驗間結(jié)果的差異。本研究以美國AIN-93實驗用嚙齒動物純化飼料配方為基礎[6]，從飼料公司專門定制，飼料中各種營養(yǎng)成分含量穩(wěn)定，保證了采用同一模型不同實驗間結(jié)果的可比性。

本研究給大鼠進食含腺嘌呤的飼料后，腺嘌呤沉積在腎小管，引發(fā)急性腎損傷，進而轉(zhuǎn)變?yōu)槁阅I臟病。從本研究第2周末和第6周末的生化數(shù)據(jù)看，隨著慢性腎臟病的進展，血肌酐、尿素氮、血磷和血PTH均逐漸上升，血鈣逐漸下降，和臨床實際情況吻合良好。

CKD時的血管鈣化主要有繼發(fā)于動脈粥樣硬化的內(nèi)膜鈣化和與動脈粥樣硬化無關的中膜鈣化。而在CKD第5期透析患者中，血管鈣化的發(fā)生率大約為50%～80%[4]。本研究較好地模擬了動脈中膜鈣化的情況，約有50%的大鼠發(fā)生中膜鈣化。

對于腎性骨病，傳統(tǒng)的分類方式是根據(jù)骨轉(zhuǎn)換和骨礦化進行分類[5]。由于上述分類方法未考慮到骨量的改變，國際腎臟病學會推出了TMV分類法，即利用骨形態(tài)計量學的方法直接從骨轉(zhuǎn)換、骨礦化及骨量三個角度對骨病進行評價[5]。本研究從TMV角度對骨病進行評價。從研究結(jié)果看，本CKD模型大鼠的骨轉(zhuǎn)換處于高水平狀態(tài)，即骨形成和骨吸收均處于高水平；CKD組大鼠的骨量明顯減少，這也反映了雖然骨形成和骨吸收均處于高水平，但骨吸收程度大于骨形成程度。骨量減少臨床上可以通過骨密度檢查間接反映出來。本研究骨密度檢查結(jié)果也和骨形態(tài)計量學的骨量檢查結(jié)果吻合。礦化方面，如果直觀地從本研究結(jié)果看存在礦化障礙，因為OS/BS和OV/BV均明顯升高，但仔細分析，考慮礦化正常，因為礦化延遲時間沒有變化，OS/BS和OV/BV升高可能是由于高骨形成率產(chǎn)生的大量類骨質(zhì)未能及時礦化導致的[1]。上述骨形態(tài)計量學變化也符合舊分類法中輕微高甲狀旁腺激素相關性骨病或纖維性骨炎的特點。

腺嘌呤誘導的慢性腎臟病大鼠模型能夠較好地模擬臨床上CKD-MBD的真實情況，礦物質(zhì)代謝相關的生化標志物方面表現(xiàn)為低血鈣、高血磷和高PTH；血管鈣化表現(xiàn)為中膜鈣化；腎性骨病方面表現(xiàn)為小梁骨高轉(zhuǎn)換、正常礦化和低皮質(zhì)骨和小梁骨骨量，也符合纖維性骨炎的特點。因此，腺嘌呤誘導的慢性腎臟病大鼠模型可以作為未來開展CKD-MBD研究的良好載體。

[1] Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) CKD-MBD Work Group. KDIGO clinical practice guideline for the diagnosis, evaluation, prevention, and treatment of Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone Disorder (CKD-MBD) [J]. Kidney Int Suppl, 2009(113): S1-S130.

[2] Jadoul M, Albert JM, Akiba T, et al. Incidence and risk factors for hip or other bone fractures among hemodialysis patients in the Dialysis Outcomes and Practice Patterns Study [J]. Kidney Int, 2006, 70(7): 1358-1366.

[3] Mittalhenkle A, Gillen DL, Stehman-Breen CO. Increased risk of mortality associated with hip fracture in the dialysis population [J]. Am J Kidney Dis, 2004, 44(4): 672-679.

[4] Okuno S, Ishimura E, Kitatani K, et al. Presence of abdominal aortic calcification is significantly associated with all-cause and cardiovascular mortality in maintenance hemodialysis patients [J]. Am J Kidney Dis, 2007, 49(3): 417-425.

[5] Moe S, Drüeke T, Cunningham J, et al. Definition, evaluation, and classification of renal osteodystrophy: a position statement from Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) [J]. Kidney Int, 2006, 69(11): 1945-1953.

[6] Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition Ad Hoc Writing Committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet [J]. J Nutr, 1993, 123(11): 1939-1951.

[7] Neven E, Dauwe S, De Broe ME, et al. Endochondral bone formation is involved in media calcification in rats and in men [J]. Kidney Int, 2007, 72(5): 574-581.

[8] Parfitt AM, Drezner MK, Glorieux FH, et al. Bone histomorphometry: standardization of nomenclature, symbols, and units. Report of the ASBMR Histomorphometry Nomenclature Committee [J]. J Bone Miner Res, 1987, 2(6): 595-610.