不同方法制備大鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型的比較

高琳琳，王 軍，李子英，劉曉梅*

(1.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗研究中心動物實驗室，沈陽 110004；2.本溪市中心醫(yī)院，遼寧 本溪 117022)

宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)兒又稱小于胎齡(small for gestational age，SGA)兒，是指出生體重低于同胎齡平均體重的第十個百分位或低于同胎齡平均體重的2個標準差的新生兒[1]。我國人群中IUGR的發(fā)生率平均為6.39%，IUGR不僅是圍產(chǎn)兒的死亡和發(fā)病的重要原因之一，而且還會增加成年后心血管疾病、糖尿病、高血壓等疾病的發(fā)生[2]。目前，IUGR動物模型有較多建立方法，包括酒精干預(alcohol intervention)法、子宮動脈結(jié)扎(uterine artery ligation)法、低蛋白飲食(low protein diet)法等；盡管制備模型的方法多樣，但是沒有公認建立IUGR模型的唯一標準[3]。

因此，穩(wěn)定而簡便地建立與人類臨床病理特征相似的IUGR模型，對研究該疾病的發(fā)生機制、疾病的治療方法具有十分重要的科學意義。本文著重介紹三種IUGR模型的造模方法比較及新生大鼠生長變化，進而探討建立IUGR模型最適合的方法及對大鼠遠期代謝的影響，為相關(guān)科學研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠33只，25只雌性，體重230～250 g，8只雄性，體重280～300 g，來源于遼寧長生生物技術(shù)有限公司 [SCXK (遼) 2015-0001]。動物飼養(yǎng)及實驗操作于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心 [SYXK (遼) 2017-0004]，隨機將雌雄比例為4∶1合籠過夜，次日做陰道涂片，在顯微鏡下檢出精子則定為受孕第0天[4]，每組為5只孕鼠，隨機分為A、U、LP、CON四組，即酒精干預組、子宮動脈結(jié)扎組、低蛋白飲食組、正常對照(normal control)組。本實驗符合倫理要求，倫理編號：2015PS41K。

1.2 主要試劑與儀器

95%乙醇，由盤錦天源藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批準文號：遼衛(wèi)藥準字(1996)第004754號，生產(chǎn)批號：20160302；0.9%氯化鈉注射液，由大連大冢制藥有限公司生產(chǎn)，批準文號：國藥準字H12020010，生產(chǎn)批號：16101138；水合氯醛，由國藥集團化學試劑有限公司提供，生產(chǎn)批號：20160705。T系列電子天平，由美國雙杰兄弟(集團)有限公司生產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 各組IUGR模型制備

酒精干預組：正常飲食飲水(熱卡約為1558 kJ/100 g、蛋白質(zhì)約為23%)，飼料由北京華阜康提供 [SCXK (京) 2014-008]，于孕第7天開始，給予孕鼠自配50%的酒精進行灌胃處理 [0.9 mL/(100 g·d)][5]。

子宮動脈結(jié)扎組：正常飲食飲水于孕第17天以水合氯醛0.3 mL/kg的劑量進行麻醉，從腹中線的位置縱切，切口約為3～4 cm，暴露子宮，用溫的生理鹽水浸潤紗布鋪在子宮表面來維持子宮的溫度及濕度，尋找子宮角動脈，結(jié)扎處平行放置一號鋼針，同時結(jié)扎子宮動脈和鋼針，后將鋼針輕輕抽出，結(jié)扎單側(cè)子宮動脈后關(guān)閉腹腔并用酒精進行消毒[6]。

低蛋白飲食組：于孕第0天給予低蛋白飲食(熱卡約為1558 kJ/100 g、蛋白質(zhì)約為8%)，飼料由北京華阜康提供 [SCXK (京) 2014-008]，每天給予低蛋白飼料[7]，正常飲水。

正常對照組：于孕第0天給予正常飲食飲水。

1.3.2 取材

孕第20天時剖宮產(chǎn)取胎鼠，隨機選取5組樣本進行考察，并測量其身長、尾長、體質(zhì)量、腦質(zhì)量、胎盤質(zhì)量、雙腎質(zhì)量、肝質(zhì)量、肺質(zhì)量；剩余部分胎鼠繼續(xù)飼養(yǎng)分別于飼養(yǎng)后3周、6周、12周隨機選取5只實驗鼠，分別對其肝臟、雙腎及腎周脂肪質(zhì)量進行測量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 實驗組胎鼠成活率及IUGR發(fā)生率的比較

子宮動脈結(jié)扎組1只孕鼠死亡，其他實驗組及對照組均無死亡。三組實驗組胎鼠IUGR發(fā)生率明顯高于對照組(P< 0.05)，實驗組胎鼠成活率明顯低于對照組(P< 0.05)，其中子宮動脈結(jié)扎組中胎鼠成活率低于其他兩組。各組的孕鼠成活數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎、IUGR發(fā)生率等詳見表1。

2.2 實驗組胎鼠體質(zhì)量、體長及臟器質(zhì)量的變化

三組實驗組胎鼠平均體質(zhì)量分別為3.741 g、3.704 g、3.525 g，明顯低于對照組胎鼠平均體質(zhì)量5.017 g(P< 0.05)，除腦質(zhì)量外，實驗組臟器質(zhì)量均明顯低于對照組臟器的平均質(zhì)量；其中，子宮動脈結(jié)扎組與低蛋白飲食組肝臟的質(zhì)量低于對照組肝臟的質(zhì)量，但差異無顯著性(P> 0.05)。各組胎鼠平均體質(zhì)量、體長及臟器質(zhì)量詳見表2，圖1、2。

2.3 實驗組胎盤比重、胎鼠肝等臟器比重的變化

三組實驗組的胎盤比重(胎盤質(zhì)量與胎鼠體質(zhì)量比)均低于對照組(P< 0.05)，且酒精干預組低于低蛋白飲食組的胎盤比重；酒精干預組肝臟比重明顯低于對照組肝臟比重(P< 0.05)，子宮動脈結(jié)扎組和低蛋白飲食組肝臟比重低于對照組肝臟比重，但差異無顯著性(P> 0.05)。各組胎鼠臟器比重詳見表3、圖3。

表1 各組孕鼠剖其胎鼠的情況

注：與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the CON group,*P< 0.05.

注：A：各組剖宮產(chǎn)胎鼠生長情況；B：各組剖宮產(chǎn)胎鼠的體質(zhì)量。A：酒精干預組；U：子宮動脈結(jié)扎組；LP：低蛋白飲食組；CON：正常對照組。與正常對照組比較，* P< 0.05。圖1 各組剖宮產(chǎn)胎鼠生長及體質(zhì)量情況Note. A: Growth of fetal rats delivered by cesarean section. B: Body mass of fetal rats delivered by cesarean section. A: Alcohol intervention group; U: Uterine artery ligation group; LP: Low protein diet group; CON: Normal control group. Compared with the CON group,*P< 0.05.Fig.1 Growth status and body mass of the fetal rats delivered by cesarean section in each group

組別Groups身長(cm)Bodylength尾長(cm)Taillength體質(zhì)量(g)Bodymass腦質(zhì)量(g)Brainmass胎盤質(zhì)量(g)Placentalmass雙腎質(zhì)量(g)Two?kidneymass肝質(zhì)量(g)Livermass肺質(zhì)量(g)LungmassA3119±02201118±01333741±0387?0142±00180339±00550035±0011?0285±0068?0134±0019U3123±01831108±01383704±0441?0148±00270345±00440036±0013?0312±00390129±0024LP3469±07931123±02743525±0290?0145±00070385±00320027±0007?0304±00850132±0015CON3691±01341241±01055017±01490151±00420453±00830054±00390377±00690138±0050

注：與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the CON group,*P< 0.05.

注：A：剖宮產(chǎn)胎鼠腦質(zhì)量；B：剖宮產(chǎn)胎鼠雙腎質(zhì)量；C：剖宮產(chǎn)胎鼠肝臟質(zhì)量。A：酒精干預組；U：子宮動脈結(jié)扎組；LP：低蛋白飲食組；CON：正常對照組。與正常對照組比較，* P< 0.05。圖2 各組剖宮產(chǎn)胎鼠的腦、雙腎、肝臟質(zhì)量Note. A: Brain mass. B: Two-kidney mass. C: Liver mass. A: Alcohol intervention group; U: Uterine artery ligation group; LP: Low protein diet group; CON: Normal control group. Compared with the CON group,* P< 0.05.Fig.2 Brain mass, two-kidney mass and liver mass of the fetal rats delivered by cesarean section in each group

組別Groups腦比重Braincoefficient胎盤比重Placentacoefficient雙腎比重Two?kidneycoefficient肺比重Lungcoefficient肝比重LivercoefficientA0041±00070075±0017?0007±00040038±00040081±0020?U0040±00070050±0015?0007±00030035±00060087±0010LP0041±00040076±0020?0009±00010036±00630085±0016CON0045±00080090±00170011±00080048±00100095±0014

注：與對照組比較，*P< 0.05。

Note. Compared with the CON group,*P< 0.05.

注：A：剖宮產(chǎn)胎鼠的腦比重；B：剖宮產(chǎn)胎鼠的胎盤比重；C：剖宮產(chǎn)胎鼠的肝比重。A：酒精干預組；U：子宮動脈結(jié)扎組；LP：低蛋白飲食組；CON：正常對照組。與正常對照組比較，* P< 0.05。圖3 各組剖宮產(chǎn)胎鼠的腦、胎盤、肝臟比重Note. A: Brain coefficient. B: Placenta coefficient. C: Liver coefficient. A: Alcohol intervention group; U: Uterine artery ligation group; LP: Low protein diet group; CON: Normal control group. Compared with the CON group, *P< 0.05.Fig.3 Brain, placenta and liver coefficients of the fetal rats delivered by cesarean section in each group

2.4 實驗組體質(zhì)量的變化

大鼠飼養(yǎng)3周后，酒精干預組、子宮動脈結(jié)扎組、低蛋白飲食組三組大鼠平均體質(zhì)量均明顯低于對照組(P< 0.05)；飼養(yǎng)6周后，實驗組大鼠平均體質(zhì)量仍低于對照組的水平，差異無顯著性(P> 0.05)；飼養(yǎng)12周后，酒精干預組、低蛋白飲食組兩組實驗組大鼠平均體質(zhì)量明顯高于對照組(P< 0.05)。各組大鼠平均體質(zhì)量增長情況詳見圖4。

2.5 12周部分臟器及腎周脂肪質(zhì)量的比較

三組實驗組測量12周肝臟、雙腎及腎周脂肪的質(zhì)量，其中，三組實驗組的肝臟、雙腎臟質(zhì)量均低于對照組，酒精干預組、低蛋白飲食組腎周脂肪質(zhì)量明顯高于對照組(P< 0.05)，子宮動脈結(jié)扎組腎周脂肪質(zhì)量高于對照組，但差異無顯著性(P> 0.05)。各組肝臟、雙腎、腎周脂肪質(zhì)量詳見圖5。

注：與正常對照組比較，* P< 0.05。圖4 各組大鼠體質(zhì)量變化Note. Compared with the CON group,* P< 0.05.Fig.4 Changes of body mass of the rats in each group

注：A：12周各組肝臟質(zhì)量；B：12周各組雙腎質(zhì)量；C：各組腎周脂肪質(zhì)量。A：酒精干預組；U：子宮動脈結(jié)扎組；LP：低蛋白飲食組；CON：正常對照組。與正常對照組比較，* P< 0.05。圖5 12周時各組大鼠肝臟、雙腎、腎周脂肪質(zhì)量情況Note. A: Liver mass. B: Two-kidney mass. C: Perirenal fat pad mass. A: Alcohol intervention group; U: Uterine artery ligation group; LP: Low protein diet group; CON: Normal control group. Compared with the CON group,* P< 0.05.Fig.5 Liver, two-kidney and perirenal fat pad mass of the rats in each group at age of 12 weeks

3 討論

宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎兒在子宮內(nèi)會出現(xiàn)器官發(fā)育不良、窒息缺氧、宮內(nèi)流產(chǎn)等現(xiàn)象，是造成圍產(chǎn)兒死亡的重要原因之一。其遠期影響是宮內(nèi)發(fā)育遲緩兒在成年后發(fā)生代謝綜合征(包括糖耐量減低、2型糖尿病)的易感性明顯增加，與成年后的心血管病、肥胖、高血壓等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[8]。作為圍產(chǎn)科學研究的熱點問題，宮內(nèi)發(fā)育遲緩發(fā)生的分子機制尚未闡明，目前認為可能與宮內(nèi)不良發(fā)育造成的持續(xù)終生的胰島素抵抗有關(guān)[9]。研究宮內(nèi)發(fā)育遲緩的近遠期并發(fā)癥，必須建立穩(wěn)定的研究模型。然而受倫理影響，人體實驗無法實現(xiàn)，因此動物宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型具有無可替代的模擬價值。

酒精干預法能成功地建造大鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型，本法最大的優(yōu)點是能精準地掌握酒精用量及孕鼠的給予劑量(mL)，缺點是酒精干預法的給予途徑是灌胃，易刺激胃腸，易影響胎鼠的正常發(fā)育[10]。在此研究中，酒精干預法對胎鼠的肝臟發(fā)育影響最為明顯[11]，因此，酒精干預法在探討制備IUGR模型對長期肝臟代謝變化中的影響值得進一步研究。

子宮動脈結(jié)扎法通過實驗操作來減少胎鼠的血液供應，并以此影響胎鼠正常發(fā)育，此實驗方法簡易，但實驗操作難度較高；結(jié)扎過緊會導致瞬間的血液供應中斷，常引起胎鼠死于宮內(nèi)而致流產(chǎn)率、死亡率上升。結(jié)扎過松則導致宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型的發(fā)生率下降[12]。在本文的三種模型制備方法中，子宮動脈結(jié)扎法存活胎鼠數(shù)最少，死亡率最高，IUGR發(fā)生率最低，這可能與手術(shù)中的麻醉和外科手術(shù)造成的失血有一定的關(guān)系。在此研究中，子宮動脈結(jié)扎法制備宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型對胎鼠腦部的影響較小，與正常對照組最為接近[13]，該造模方法對研究腦部的影響不具有說服力，同時該造模方法在制備大鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型時，對實驗人員專業(yè)的外科技術(shù)要求較為嚴格，不具有普及性與推廣性；而且，該實驗組的體質(zhì)量始終低于對照組，沒有明顯的生長追趕，12周腎周脂肪質(zhì)量無明顯增加[14]。因此，對于追趕性生長的相關(guān)研究也不適宜采取此類造模方法。

低蛋白飲食法是通過減少母鼠飲食中的蛋白質(zhì)含量來減少供給胎鼠的蛋白質(zhì)，從而限制了胎鼠的發(fā)育[15]。此方法對實驗飼料配制、飼料中營養(yǎng)水平的控制、飼料飼喂時間的控制等要求嚴格。本實驗采用北京華阜康公司的低蛋白飼料，成功構(gòu)建了IUGR大鼠模型，此方法制備大鼠宮內(nèi)發(fā)育遲緩模型成功率高，死亡率低，孕鼠接近自然狀態(tài)，無刺激、無創(chuàng)傷，而且效果穩(wěn)定，相比于其他方法具有不可替代的優(yōu)勢，12周時出現(xiàn)了明顯的追趕性生長，腎周脂肪質(zhì)量增長明顯，對脂肪沉積及肥胖發(fā)生相關(guān)研究起著重要的作用。

通過上面三種建立IUGR的實驗方法可知，酒精干預法、子宮動脈結(jié)扎法、低蛋白飲食法均可成功建立IUGR的實驗動物模型；本實驗三種模型建立方法，對腦質(zhì)量的影響很小，說明大鼠本身具有腦保護效應[16]；在本實驗所涉及的實驗方法中，子宮動脈結(jié)扎法IUGR發(fā)生率低，死亡率高，不是建立IUGR模型的首選，酒精干預法和低蛋白飲食法均可很好地建立IUGR模型，而且低蛋白飲食法較酒精干預法IUGR發(fā)生率高，死亡率更低，因此，低蛋白飲食法可作為建立IUGR模型的首選之一。本研究目前只是初步研究了各組模型中胎鼠的死亡率，胎鼠出生后的體質(zhì)量、臟器質(zhì)量，胎鼠到成年鼠的體重變化，并未深入研究追趕性生長這個危險因素，因此IUGR的遠期代謝影響值得進一步研究。

[1] 萬婷, 何援利, 潘石蕾. 建立胎兒生長受限大鼠動物模型的實驗研究 [J]. 實用醫(yī)學雜志, 2011, 27(12): 2133-2135.

[2] 朱秋鳳, 張衛(wèi)輝, 黃進, 等. 胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩胎盤形態(tài)學的研究進展 [J]. 畜牧與獸醫(yī), 2008, 40(6): 103-106.

[3] 李瑤. 宮內(nèi)發(fā)育遲緩對胰腺β細胞發(fā)育和功能影響機制的研究進展 [J]. 國際兒科學雜志, 2011, 38(2): 124-126.

[4] 何秋明, 肖尚杰, 夏慧敏, 等. 大鼠陰道涂片的觀察 [J]. 廣州醫(yī)學院學報, 2007, 35(4): 54-56.

[5] 劉彥慧, 劉振宅, 梁明輝. IUGR動物模型建立及宮內(nèi)胚胎心電改變的研究 [J]. 齊齊哈爾醫(yī)學院學報, 2005, 26(6): 614-615.

[6] Wigglesworth JS. Experimental growth retardation in the foetal rat [J]. J Pathol Bacteriol, 1964, 88: 1-13.

[7] Fernandez-Twinn DS, Ozanne SE, Ekizoglou S, et al. The maternal endocrine environment in the low-protein model of intra-uterine growth restriction [J]. Br J Nutr, 2003, 90(4): 815-822.

[8] Gluckman PD, Harding JE. The physiology and pathophysiology of intrauterine growth retardation [J]. Horm Res, 1997, 48 Suppl 1: 11-16.

[9] 程海霞, 孫麗霞, 薛萍. 低出生體質(zhì)量早產(chǎn)兒宮外生長發(fā)育狀況的探討 [J]. 中國醫(yī)藥指南, 2016, 14(9): 180-181.

[10] Guo W, Gregg JR, Fonkalsrud EW. Effect of maternal ethanol intake on fetal rabbit gastrointestinal development [J]. J Pediatr Surg, 1994, 29(8): 1030-1033.

[11] 柳云恩, 姚寶玉, 楊冬華, 等. 不同周齡SD大鼠臟器重量及其變化趨勢分析 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2012, 22(1): 22-27.

[12] Phillips ID, Anthony RV, Simonetta G, et al. Restriction of fetal growth has a differential impact on fetal prolactin and prolactin receptor mRNA expression [J]. J Neuroendocrinol, 2001, 13(2): 175-181.

[13] 陳聯(lián)輝, 梁黎. 宮內(nèi)生長遲緩對生后脂代謝的影響及其機制 [J]. 國際兒科學雜志, 2014, 41(4): 347-350.

[14] 郭麗, 李超, 李淑媛, 等. 長期低劑量金雀異黃素導致雄性子代大鼠肥胖及其機制研究 [J]. 中國醫(yī)藥導報, 2017, 14(6): 12-14.

[15] 吳秋玨, 呂佳琪, 王恬. 營養(yǎng)不良對宮內(nèi)胎兒發(fā)育遲緩動物模型影響的研究進展 [J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38(2): 232-236.

[16] Moloney AM, Griffin RJ, Timmons S, et al. Defects in IGF-1 receptor, insulin receptor and IRS-1/2 in Alzheimer’s disease indicate possible resistance to IGF-1 and insulin signaling [J]. Neurobiol Aging, 2010, 31(2): 224-243.