葡萄酒中氨基甲酸乙酯的變化規(guī)律及控制研究

朱亞楠，吳玉文，王煥香，商華，傅曉方，郜成軍，趙曉寧，馮振亮，鄭紫淼

（中國(guó)長(zhǎng)城葡萄酒有限公司，河北懷來 075400）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC）廣泛存在于煙草葉及香煙的一種天然成分，是發(fā)酵食品和酒精飲料（如葡萄酒、白酒和黃酒等）生產(chǎn)中所產(chǎn)生的一種代謝物質(zhì)[1-3]。早在1943年就被證實(shí)是一種致癌物質(zhì)。研究表明，EC是一種多位點(diǎn)致癌物，可導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物肺癌、淋巴癌、肝癌和皮膚癌等疾病，并且乙醇對(duì)EC的致癌性有促進(jìn)作用[4-5]。

1985年，加拿大政府首次規(guī)定了不同酒精飲料中EC的最高含量[6]，美國(guó)就當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的食品采取自愿制定EC安全含量標(biāo)準(zhǔn)的做法，歐盟一些成員國(guó)也規(guī)定了酒精飲品中EC最高限量。在亞洲，韓國(guó)規(guī)定葡萄酒的EC最高限量30 μg/L，而中國(guó)目前還未對(duì)葡酒中的EC進(jìn)行限量規(guī)定。目前，隨著食品安全趨勢(shì)發(fā)展和消費(fèi)者對(duì)食品安全的關(guān)注，我國(guó)發(fā)展歷史較短的葡萄酒行業(yè)由于缺乏系統(tǒng)對(duì)葡萄酒EC含量等的安全性評(píng)估，其產(chǎn)品質(zhì)量安全頻繁受到國(guó)外質(zhì)疑。國(guó)內(nèi)目前對(duì)EC的研究集中在萄汁中精氨酸、尿素、瓜氨酸對(duì)葡萄酒中含量的影響以及發(fā)酵溫度、釀酒酵母菌種類、酵母泥陳釀技術(shù)對(duì)含量影響[7-10]。本文分析了葡萄酒釀造工藝條件對(duì)氨基甲酸乙酯生成的影響，降低氨基甲酸乙酯生成量的釀造工藝條件，并測(cè)定了我國(guó)不同類型的干紅和干白葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量，以期為我國(guó)葡萄酒安全標(biāo)準(zhǔn)中氨基甲酸乙酯限量指標(biāo)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

天然葡萄汁：2016年赤霞珠（Cabernet Sauvignon），10月5日采摘于長(zhǎng)城葡萄基地，破碎除梗后添加0.04 g/L果膠酶和60 mg/L SO2。

土壤：收集于長(zhǎng)城釀酒葡萄園5個(gè)不同地塊土壤，采收后進(jìn)行密封保存，并送檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)。

葡萄酒樣品：原酒產(chǎn)地涉及山東煙臺(tái)4個(gè)、河北沙城9個(gè)、河北昌黎7個(gè)、新疆五家渠5個(gè)等主要產(chǎn)區(qū)，品種主要有‘赤霞珠’‘美樂’‘西拉’‘龍眼’‘霞多麗’‘雷司令’。

發(fā)酵輔料：AWRI796酵母（澳/maurivin）、CY3079酵母（法/萊蒙特）、發(fā)酵助劑 Fermaid KTM（拉弗德）。

設(shè)備：90 t發(fā)酵罐、葡萄酒瓶、5 L廣口瓶、打塞器、FOSS葡萄酒分析儀。

1.2 土壤和原料檢測(cè)方法

在葡萄生長(zhǎng)季節(jié)以及采收期選取沙城產(chǎn)區(qū)5塊不同的釀酒葡萄園，每塊葡萄園采用“S”形取樣法或者五點(diǎn)交叉取樣法取樣，取樣深度為30 cm，各個(gè)取樣點(diǎn)土層深度、取土厚度和寬窄一致；裝入干凈的塑料袋中即可。土壤樣品中的水解性氮含量按照LY/T 1228—2015中的容量法進(jìn)行檢測(cè)。

2016年10月原料成熟后采摘上述5塊葡萄園中的赤霞珠葡萄，通過FOSS葡萄酒分析儀進(jìn)行可吸收氮含量的檢測(cè)，然后將5個(gè)地塊的葡萄按照同一發(fā)酵工藝進(jìn)行發(fā)酵，所發(fā)酵的原酒采用固相萃?。⊿PE）結(jié)合GC-MS法測(cè)定原酒中EC的含量[11-12]。

1.3 發(fā)酵過程中輔料添加方法

選取上述基地中可吸收氮含量不同的4份原料，每份原料平均分為2組，將發(fā)酵助劑設(shè)置為單因素變量，一組在發(fā)酵過程中添加助劑，一組不加，發(fā)酵結(jié)束后采用SPE結(jié)合GC-MS法測(cè)定原酒中EC的含量。

1.4 葡萄酒儲(chǔ)存時(shí)間與存儲(chǔ)溫度分析方法

從公司產(chǎn)品留樣室中選取2007—2013年赤霞珠干紅葡萄酒和2006—2011年龍眼干白葡萄酒，采用SPE結(jié)合GC-MS法測(cè)定EC含量。選取2004—2005和2007—2009年的赤霞珠干紅葡萄酒在10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃儲(chǔ)存條件下的產(chǎn)品，每半年對(duì)葡萄酒中的EC含量進(jìn)行測(cè)定分析[13]。

表1 不同土壤和葡萄氮含量與原酒中EC含量Table 1 Grape nitrogen content and the raw wine EC content in different soil

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤和原料的含氮量與葡萄酒中EC含量的關(guān)系

由表1可以看出，土壤中的水解性氮含量與原料中的可吸收氮含量以及原酒中的EC含量有密切的關(guān)系，土壤中的氮元素含量越高，原料中的可吸收氮含量也越高，最終使得原酒中EC的含量也越高。因此，種植過程中要盡量控制氮肥的使用，使原料可吸收氮含量控制在160～180 mg/L。

2.2 發(fā)酵過程中的發(fā)酵助劑的添加對(duì)原酒中EC含量的影響

由表2可以看出，原酒中的EC含量和原料中的可吸收氮含量呈正相關(guān)；相同可吸收氮含量的原料，在發(fā)酵過程中使用發(fā)酵助劑的原酒比未使用發(fā)酵助劑的原酒EC含量高，其中可吸收氮小于190 mg/L的原料添加助劑和未添加助劑的原酒EC含量差別較小，而高于190 mg/L的原料在發(fā)酵過程中添加助劑與未添加助劑則差別較大，由此可以得出，對(duì)于原料可吸收氮高于190 mg/L時(shí)，在發(fā)酵過程中盡量控制發(fā)酵助劑的使用。

表2 發(fā)酵助劑的添加對(duì)赤霞珠原酒EC含量的影響Table 2 Effects of fermentation auxiliaries on the EC content of Cabernet Sauvignon raw wine

2.3 國(guó)內(nèi)各個(gè)產(chǎn)區(qū)葡萄酒EC含量分析以及貯存過程葡萄酒EC含量的影響因素

通過表3數(shù)據(jù)可以看出，新發(fā)酵原酒EC含量較低，基本集中在10 μg/L以下，有個(gè)別原酒數(shù)值高于10 μg/L，可以說明新疆發(fā)酵原酒EC含量均保持在較低的范圍內(nèi)。

從樣品留樣室中選取龍眼干白不同年份的留存樣品，進(jìn)行檢測(cè)對(duì)比，分析儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)產(chǎn)品中EC含量的影響。

由圖1可以看出干紅、干白原酒在儲(chǔ)存過程中，隨著儲(chǔ)存時(shí)間的增長(zhǎng)，原酒中EC含量呈增加的趨勢(shì)。

表3 不同產(chǎn)區(qū)、品種原酒中的EC含量Table 3 EC content of raw wine in different producing regions and varieties

圖1 沙城產(chǎn)區(qū)不同儲(chǔ)存時(shí)間的葡萄酒產(chǎn)品EC含量的變化Figure 1 Changes in EC content of wine products in different storage time in Shacheng

為發(fā)現(xiàn)原酒中EC含量是否與貯存溫度有關(guān)系，我們儲(chǔ)存溫度為10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃的庫房取相同年份的成品酒，進(jìn)行EC含量的對(duì)比，

由圖2可以清楚的發(fā)現(xiàn)，葡萄酒中的EC含量與儲(chǔ)存時(shí)間和儲(chǔ)存溫度有明顯的相關(guān)性，隨著儲(chǔ)存溫度升高、儲(chǔ)存時(shí)間的增長(zhǎng)葡萄酒中EC含量也在升高。有研究表明，溫度是促進(jìn)酒中EC產(chǎn)生速率的重要因素[14]。

圖2 沙城產(chǎn)區(qū)成品酒在不同儲(chǔ)存溫度條件下EC含量的變化Figure 2 Changes of EC content in different storage temperature of wine in Shacheng

3 討論與結(jié)論

EC是一種主要產(chǎn)生于發(fā)酵食品和飲料中的致癌物質(zhì)。哪種物質(zhì)是影響氨基甲酸乙酯含量的主要前體物質(zhì)，哪些途徑是葡萄酒中氨基甲酸乙酯合成的主要路徑，目前沒有相關(guān)的研究報(bào)道。因此，某種意義上說，葡萄酒及其前體物質(zhì)代謝生成機(jī)制及控制技術(shù)的研究仍有待于探討與研究[15]。近年來，各國(guó)食品安全部門有關(guān)EC的報(bào)道不斷出現(xiàn)，并紛紛出臺(tái)相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。目前，我國(guó)還沒有對(duì)包括葡萄酒在內(nèi)的發(fā)酵飲料和食品中EC含量進(jìn)行限定的標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)[16]。

通過對(duì)我國(guó)主要產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品EC含量的分析發(fā)現(xiàn)，新釀葡萄酒中EC含量在2.17～13.05 μg/L，樣品間差異較大。紅葡萄酒中EC含量高于白葡萄酒。我國(guó)葡萄酒中EC含量的標(biāo)準(zhǔn)建議新釀原酒的EC含量低于30 μg/L。在EC含量控制方面應(yīng)該關(guān)注葡萄栽培中氮肥的大量使用，以免葡萄的可吸收氮含量過高；發(fā)酵過程中助劑的添加，如果原料可吸收氮含量高于190 mg/L時(shí)將控制發(fā)酵助劑的使用，在發(fā)酵過程中控制發(fā)酵溫度低于35 ℃；儲(chǔ)存溫度和時(shí)間，葡萄酒產(chǎn)品EC含量隨著儲(chǔ)存溫度的升高、儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，應(yīng)在低于40 ℃環(huán)境中儲(chǔ)存，并且盡快飲用。

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