上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)側(cè)流免疫夾心法檢測(cè)麻風(fēng)患者和家庭接觸者PGL-I抗體水平

張信輝 楊梨麗 楊 琴 趙廷芳 楊昌明 戴 乾 元 康 翁小滿 溫 艷 Anouk. van Hooij Paul Corstjens Annemieke Geluk 賴雅芳 付 云 李進(jìn)嵐

麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium Leprae, ML)是麻風(fēng)的病原體，麻風(fēng)是嚴(yán)重影響人類身心健康的疾病。目前早診斷與早治療依然是控制麻風(fēng)的基石，涂片查菌陽(yáng)性率低和缺乏特異性延遲了麻風(fēng)早期診斷及治療。但因多菌型(MB)麻風(fēng)患者細(xì)胞免疫力缺陷，體液免疫力與正常人接近，而少菌型(PB)與MB相反，造成免疫檢測(cè)困難[1]；另 ML 抗原大多與結(jié)核分枝桿菌(Mtb)、 非結(jié)核分枝桿菌(NTM)有交叉反應(yīng)，也限制了免疫診斷的發(fā)展。目前診斷的麻風(fēng)病人，通常發(fā)現(xiàn)較晚，即使采用了有效的聯(lián)合化療(MDT)，依然有相當(dāng)多的治愈病人因麻風(fēng)病所致神經(jīng)損傷而造成畸殘[2]。早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療麻風(fēng)病，是切斷傳播途徑、減少麻風(fēng)致殘的先決條件。從麻風(fēng)患者的家屬(家內(nèi)接觸者)中監(jiān)測(cè)到臨床極易忽略的早期感染者及潛在的麻風(fēng)患者十分困難。麻風(fēng)患者PGL-I血清水平與細(xì)菌指數(shù)(BI)相關(guān)[11]，通過(guò)對(duì)PGL-I抗體檢測(cè)結(jié)果的分析，密切監(jiān)測(cè)PGL-I抗體水平的變化，評(píng)估發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。本研究旨在判斷該實(shí)驗(yàn)對(duì)疾病發(fā)病的預(yù)測(cè)價(jià)值，并提供一種新的診斷麻風(fēng)感染的有效診斷方法。

1 材料和方法

1.1 UCP-LFA反應(yīng)管及檢測(cè)試劑由本項(xiàng)目合作單位(荷蘭萊頓大學(xué)醫(yī)學(xué)中心傳染病研究所)Annemieke GelukA教授自主研發(fā)[9，10]。項(xiàng)目期間在麻風(fēng)流行地區(qū)采集下列研究對(duì)象肝素抗凝全血標(biāo)本進(jìn)行UCP-LFA檢測(cè)分析：①未服藥的新確診麻風(fēng)患者(排除復(fù)發(fā)患者)60例；②患者家屬(與麻風(fēng)患者共同生活半年以上)87名；③正常人(與麻風(fēng)患者無(wú)共同生活史)56名。

1.2 采集肝素抗凝全血，3 h內(nèi)分裝在反應(yīng)管內(nèi)(每管全血1 mL以上)，即刻放入37℃水浴箱孵育20～24 h，孵育結(jié)束后轉(zhuǎn)存-20℃以下冰箱待檢。

1.3 ①測(cè)試前，將反應(yīng)管內(nèi)的樣本室溫解凍，4500 g離心10 min。②吸取上清液(4 uL)至96孔稀釋板中(每孔預(yù)加200 uL buffer)，避免吸到細(xì)胞層，按標(biāo)本編號(hào)順序排列。③將顯色劑(UCP)水浴超聲振蕩器處理后每孔加2 uL；④將PGL-1檢測(cè)試紙條(批號(hào)：170405)放入稀釋板各樣本孔中，直至試紙條干燥。⑤用LUMC(Leiden University Medical Center)結(jié)果判讀儀逐個(gè)讀取檢測(cè)結(jié)果(相對(duì)熒光單位 RFUs),并計(jì)算T/FC比值以判斷陰陽(yáng)性。

2 結(jié)果

本次研究樣本共203份，其中患者60份，家內(nèi)接觸者87份，正常對(duì)照組56份，檢測(cè)失敗2份，有效結(jié)果共201份。

2.1 臨界值確定 根據(jù)labrox結(jié)果判讀儀(LUMC)讀取的檢測(cè)值和計(jì)算的ROC曲線來(lái)確定臨界值。測(cè)試線和流量控制線的波峰面積比(R)，Windows下GraphPad Prism version 7.00軟件(GraphPad Software，拉霍亞加利福尼亞，美國(guó))計(jì)算Youden指數(shù)確定最佳試驗(yàn)界限(圖1)。經(jīng)計(jì)算將臨界值確定為0.29。

計(jì)算ROC曲線(receiver operating characteristic curve)以評(píng)估PGL-I的診斷潛力，區(qū)分麻風(fēng)病人、家內(nèi)接觸者和健康人。PGL-I能區(qū)分LL/BL 、BT/TT患者和EC、HHC(圖2)，顯示出對(duì)BL/LL患者有極好的顯著性，對(duì)BT/TT患者有良好的顯著性(表1)。

表1 曲線下面積的顯著性(AUC)

2.2 PGL-I IgM陽(yáng)性率

2.2.1 按患者、家內(nèi)接觸者和正常對(duì)照分組，計(jì)算PGL-I IgM陽(yáng)性率，其陽(yáng)性率分別為81.4%、5.7%和1.8%。患者組PGL-I IgM陽(yáng)性率明顯高于其余兩組，家內(nèi)接觸者組PGL-I IgM陽(yáng)性率又明顯高于正常對(duì)照組。三組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=126.47,P<0.005)，見(jiàn)圖3。

2.2.2 按少菌型(PB)和多菌型(MB)分組計(jì)算PGL-I IgM陽(yáng)性率，其陽(yáng)性率分別為44.5%和89.4%。MB患者PGL-I IgM陽(yáng)性率明顯高于PB患者。兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.181,P<0.005)，見(jiàn)圖4。1例未定型麻風(fēng)(I)未納入分析。

2.2.3 按BI值陰陽(yáng)性對(duì)患者分組， BI+、BI-患者其PGL-I IgM陽(yáng)性率分別為83%、0%。BI+ 組PGL-I IgM陽(yáng)性率明顯高于BI- 組。兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.560,P<0.005)，見(jiàn)圖5。

圖1 檢測(cè)線(T)一個(gè)正信號(hào)(a)和一個(gè)負(fù)信號(hào)(b)；流量控制(FC)峰值為內(nèi)部對(duì)照?qǐng)D2 ROC曲線以評(píng)估PGL-I的診斷潛力，區(qū)分麻風(fēng)病人、家內(nèi)接觸者和健康人圖3 麻風(fēng)患者、家內(nèi)接觸者和正常對(duì)照分組PGL-I IgM陽(yáng)性率

圖4 不同型別PGL-I IgM陽(yáng)性率

圖5 BI值陽(yáng)性與陰性者的PGL-I IgM陽(yáng)性率

3 討論

研究結(jié)果顯示，患者、家內(nèi)接觸者、正常對(duì)照組PGL-I IgM陽(yáng)性率分別是81.4%、5.7%和1.8%。患者組PGL-I IgM陽(yáng)性率明顯高于其余兩組，家內(nèi)接觸者組PGL-I IgM陽(yáng)性率又明顯高于正常對(duì)照組。三個(gè)組別之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=126.47,P<0.005)。多菌型(MB)PGL-I IgM陽(yáng)性率(89.4%)明顯高于少菌型(PB)(45.5%)。三個(gè)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.181,P<0.005)。雖然少菌型(BT/TT)患者中檢測(cè)IgM類抗體陽(yáng)性率不高，不能用于人群篩選，但可用于:為治療目的區(qū)分MB和PB[4，12]；早期預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)或發(fā)病[4,5]；在高危人群(如家內(nèi)接觸者)中發(fā)現(xiàn)發(fā)病危險(xiǎn)者。按BI值陰陽(yáng)性對(duì)患者分組， BI+、BI-患者其PGL-I IgM陽(yáng)性率分別為83%、0%。BI+組PGL-I陽(yáng)性率明顯高于BI-組，兩個(gè)組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=17.560,P<0.005)，其他學(xué)者的研究結(jié)果亦表明血抗麻風(fēng)分枝桿菌IgM類抗體的水平與BI呈線性相關(guān)[11]，故在麻風(fēng)患者家內(nèi)接觸者中檢出PGL-I IgM抗體水平高的個(gè)體，對(duì)該個(gè)體的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。

家內(nèi)接觸者PGL-I IgM檢測(cè)陽(yáng)性(T/FC比值>0.29)5例(5/87)，其中，3例為父/母子，2例為夫妻，接觸的患者4例為多菌型(BL/LL)、1例為未定型麻風(fēng)；另有5例家內(nèi)接觸者PGL-I IgM檢測(cè)值偏高(T/FC比值=0.25～0.29),其中，3例為父/母子，1例為夫妻，1例為兄弟，且接觸患者均為多菌型。家內(nèi)接觸者幾乎與麻風(fēng)患者共同生活,有極易被感染的環(huán)境條件,一些早期發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)有家族聚集現(xiàn)象的學(xué)者,證實(shí)遺傳因素在麻風(fēng)病學(xué)中起到重要作用,由于在這些易感家族中有相同的易感因素和相同的生活環(huán)境,故他們患麻風(fēng)的危險(xiǎn)性較無(wú)親屬患麻風(fēng)的人群高[8]。也有研究表明，多菌型接觸者中PGL-I抗體陽(yáng)性者發(fā)病危險(xiǎn)性比陰性高8倍以上[3,4,6,7]。故本次篩查發(fā)現(xiàn)的5例PGL-I IgM陽(yáng)性及5例PGL-I IgM檢測(cè)值偏高的接觸者，可視為麻風(fēng)發(fā)病危險(xiǎn)者，均應(yīng)密切隨訪[4]，尤其以6例父/母子關(guān)系的接觸者為隨訪重點(diǎn)。

55例正常對(duì)照組中，1例PGL-I檢測(cè)陽(yáng)性。自述出生于我省麻風(fēng)流行地區(qū)(生活史5年)，家內(nèi)無(wú)明確診斷的麻風(fēng)患者，應(yīng)密切隨訪。

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