沉默干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖能力影響的研究

冀 靜，左 萍，黃康榕，劉海娟，方 靜，王月玲

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安，710061；2.西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710004)

宮頸癌是女性最常見的婦科惡性腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)每年新發(fā)病例約52.76萬(wàn)，死亡26.57萬(wàn)，居發(fā)展中國(guó)家女性癌癥死亡原因第三位[1]。在我國(guó)，年輕女性發(fā)病率亦逐年升高，雖然人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)，但目前宮頸癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍未完全闡明。Sox2(SRY-related high-mobility-group box2)基因是迄今為止最早發(fā)現(xiàn)的干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子之一，在維持胚胎干細(xì)胞的多潛能性、自我更新能力、器官發(fā)生、細(xì)胞分化等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Sox2亦參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，如乳腺癌、肺癌等[3-4]。Singh等早在2012年就從非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中分離出具有干細(xì)胞特征的SP(side population)細(xì)胞，其Sox2、Oct4(octamer-binding transcription factor 4)和Nanog(nanog homeobox)表達(dá)升高；而通過(guò)siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染下調(diào)Sox2基因的表達(dá)后，SP細(xì)胞的增殖能力下降[4]。Sox2也可以通過(guò)調(diào)控G1/S-特異性周期蛋白-D3(G1/S-specific cyclin-D3 ，CCND3)、G1/S-特異性周期蛋白-D1(G1/S-specific cyclin-D1，CCND1)、p21(cyclin-dependent kinase inhibitor 1，p21)等多個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因改變細(xì)胞周期進(jìn)程從而加速細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變及增殖。在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中Sox2的表達(dá)明顯高于正常宮頸組織，并且Sox2的表達(dá)與病理分級(jí)相關(guān)[5]。為了進(jìn)一步探討Sox2在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本實(shí)驗(yàn)在高表達(dá)Sox2的宮頸鱗癌C33A細(xì)胞中穩(wěn)定沉默Sox2基因的表達(dá)，探討下調(diào)Sox2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響及其可能的機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要試劑

人宮頸鱗癌細(xì)胞株C33A由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中心惠存，胎牛血清購(gòu)自法國(guó)Biowest公司；Sox2基因shRNA干擾質(zhì)粒、qPCR引物購(gòu)自美國(guó)Gene Copoeia公司；轉(zhuǎn)染試劑Turbo Fect購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司；反轉(zhuǎn)錄、qPCR試劑盒購(gòu)自Takara寶生物工程有限公司；嘌呤霉素，兔抗人Sox2、β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；DMEM高糖培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)、胰酶、四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, MTT)]、碘化丙啶(propidium iodide, PI)、Rnase酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

宮頸癌C33A細(xì)胞常規(guī)置于恒溫37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度時(shí)，用0.25%胰酶常規(guī)消化、傳代培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的建立

轉(zhuǎn)染嚴(yán)格參照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect的說(shuō)明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染前24h，取2×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C33A細(xì)胞接種于35mm平皿中，置37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染當(dāng)天將shRNA質(zhì)粒、對(duì)照組NC質(zhì)粒分別與轉(zhuǎn)染試劑按比例混勻后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后12h換液，加入2mL新鮮含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染24h后，胰酶常規(guī)消化細(xì)胞，按照1：2比例接種到100mm平皿中，并加入嘌呤霉素(600ng/mL)進(jìn)行壓力篩選3～4周，在熒光顯微鏡下挑取標(biāo)記的綠色單克隆并擴(kuò)增、傳代，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增法(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)驗(yàn)證。

1.4 Western blot檢測(cè)Sox2蛋白、cyclinD1蛋白表達(dá)情況

穩(wěn)定干擾的克隆株細(xì)胞(干擾組shRNA-Sox2-C33A和對(duì)照組shRNA-NC-C33A細(xì)胞)擴(kuò)增后，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，ABC試劑盒測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)煮沸變性后，取40μg/孔上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入兔抗人Sox2單克隆抗體(1: 1 000)，兔抗人β-actin單克隆抗體(1：1 000)，兔抗人cyclinD1抗體(1:500)，4℃孵育過(guò)夜。次日TBST(Tris-Buffered Saline and Tween-20)緩沖液洗膜4次后，HRP-山羊抗兔(1: 5 000)37℃孵育1 h，使用TBST再次洗膜3次，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光法顯色并曝光，灰度分析目的蛋白與內(nèi)參β-actin的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的干擾組shRNA-Sox2-C33A細(xì)胞及其對(duì)照組細(xì)胞以1×104cell/孔密度接種于24孔板，分別培養(yǎng)1d、3d、5d、7d后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL DMEM+100μL MTT(5 mg/mL)，37℃培養(yǎng)箱避光孵育4 h。將24孔板1 000rpm離心5min，棄上清，每孔中加入250μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，避光震蕩混勻10min，設(shè)置調(diào)零孔、空白對(duì)照孔，每組6個(gè)復(fù)孔，酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)的各孔吸光度值(optical density，OD值)。

1.6平板克隆實(shí)驗(yàn)

將穩(wěn)定干擾的兩組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，計(jì)數(shù)，分別以200cell/孔接種于60mm平皿中，搖勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周，取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，甲醇固定后0.1%結(jié)晶紫染色30min，純水洗滌后，計(jì)數(shù)克隆并計(jì)算克隆形成率(%)=克隆數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)目×100%。

1.7流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布變化

胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的干擾組細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞，制成2×105/mL的細(xì)胞懸液，采用冰預(yù)冷PBS(phosphate buffered saline, PBS)洗滌2次，75%冰乙醇4℃固定30min，1 000rpm離心5min去除乙醇并使用冷PBS洗滌細(xì)胞，再次收集細(xì)胞向其加入400μLPI染液(500μg/mL)，置于室溫使其避光染色30min。過(guò)300目尼龍網(wǎng)濾去細(xì)胞團(tuán)塊，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期(美國(guó)BD公司)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±S)表示，組間差異采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1穩(wěn)定干擾Sox2基因的C33A單克隆細(xì)胞株的建立及鑒定

C33A細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染shRNA-Sox2質(zhì)粒或其對(duì)照質(zhì)粒后，在含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中壓力培養(yǎng)3～4周形成肉眼可見白色克隆，在熒光顯微鏡下挑取綠色熒光標(biāo)記的克隆繼續(xù)培養(yǎng)、傳代、擴(kuò)增，提取RNA后行qPCR實(shí)驗(yàn)鑒定：和對(duì)照組shRNA-NC-C33A細(xì)胞相比，干擾組shRNA-Sox2-C33A細(xì)胞中Sox2基因mRNA(messenger RNA)相對(duì)表達(dá)量為0.45±0.12，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.94，P<0.01)，見圖1。表明我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定干擾Sox2基因的C33A細(xì)胞(shRNA-Sox2-C33A)及其對(duì)照組細(xì)胞(NC-Sox2-C33A)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：**P<0.01。

圖1 qPCR法鑒定穩(wěn)定干擾Sox2的C33A細(xì)胞克隆株

Fig.1 Identifying of stably transfected shRNA-Sox2 in C33A cell clones by qPCR

2.2 Sox2基因?qū)m頸鱗癌C33A細(xì)胞增殖能力的影響

MTT結(jié)果顯示(圖2)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，干擾組shRNA-Sox2-C33A細(xì)胞的增殖速度明顯慢于對(duì)照組shRNA-NC-C33A細(xì)胞，兩組細(xì)胞的OD值在第5d后差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.93，P<0.05)，表明干擾Sox2基因表達(dá)能夠抑制宮頸癌C33A細(xì)胞的增殖。

注：*P<0.05;**P<0.01。

圖2 MTT法檢測(cè)穩(wěn)定沉默Sox2后C33A細(xì)胞增殖曲線

Fig.2 Growth curves of C33A cell after stably transfected with shRNA-Sox2 by MTT

2.3 Sox2基因?qū)m頸鱗癌C33A克隆形成能力的影響

在培養(yǎng)皿中接種相同細(xì)胞數(shù)并培養(yǎng)2周后，干擾組shRNA-Sox2-C33A組的克隆形成率為(20.33±3.51)%，而對(duì)照組shRNA-NC-C33A細(xì)胞的克隆形成率為(44.67±5.51%)，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.30，P<0.01)，見圖3，結(jié)果表明Sox2被干擾后C33A細(xì)胞的增殖能力顯著減弱。

注：**P<0.01。

圖3穩(wěn)定沉默Sox2后C33A細(xì)胞的克隆形成能力

Fig.3 Colony formation ability of C33A cell after stably silencing of Sox2

2.4 Sox2基因?qū)m頸鱗癌C33A細(xì)胞周期分布的影響

細(xì)胞周期測(cè)定(圖4)發(fā)現(xiàn)：Sox2表達(dá)下調(diào)之后，干擾組shRNA-Sox2-C33A細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例為(60.21±2.61)%，顯著高于對(duì)照組shRNA-NC-C33A細(xì)胞(45.60±4.83)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.60，P<0.01)；而對(duì)于S期和G2/M期而言，對(duì)照組細(xì)胞的比例都高于干擾組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為4.67、3.08，均P<0.05)。細(xì)胞周期的結(jié)果表明沉默Sox2表達(dá)后宮頸癌C33A細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1。

圖4穩(wěn)定沉默Sox2對(duì)C33A細(xì)胞周期的影響

Fig.4 Influence on cell cycles of C33A cell by stably silencing of Sox2

2.5下調(diào)Sox2基因?qū)m頸癌細(xì)胞CyclinD1表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌細(xì)胞中干擾Sox2表達(dá)后，與對(duì)照組細(xì)胞相比，干擾組shRNA-Sox2-C33A細(xì)胞的細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=113.79，P<0.05)，見圖5。

圖5 Western blot法檢測(cè)CyclinD1表達(dá)

Fig.5 CyclinD1 expression detected by Western blot

3討論

3.1干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2的研究現(xiàn)狀

Sox2基因是SOX(SRY-like HMG box)基因家族成員之一，位于人染色體3q26.3～q27，它和Oct4基因一樣處于干細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中心，在維持胚胎干細(xì)胞自我更新、神經(jīng)發(fā)育、多向分化等發(fā)面發(fā)揮重要的作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)Sox2不僅維持胚胎干細(xì)胞的自我更新能力和多潛能性，而且也是腫瘤干細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，其表達(dá)的微小改變都將影響腫瘤干細(xì)胞的增殖和克隆形成能力[6]。目前已有大量研究表明Sox2基因的表達(dá)與多種惡性腫瘤的生物學(xué)行為相關(guān)，例如在乳腺癌[3]、胰腺癌[7]中，Sox2作為一個(gè)原癌基因的角色，其高表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和自我更新能力，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡；在喉癌[8]中Sox2基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，在肺鱗癌中Sox2的高表達(dá)可延長(zhǎng)患者的無(wú)瘤生存期[9]。

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Sox2在正常宮頸組織中僅為25%，且多集中在基底膜處，在宮頸癌組織中的表達(dá)為77.5%，且與病理分級(jí)相關(guān)[5]，這一結(jié)果提示Sox2在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用。接著，從新鮮的宮頸癌細(xì)胞中懸浮培養(yǎng)出宮頸癌腫瘤球細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化后腫瘤球貼壁生長(zhǎng)，免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sox2在宮頸癌腫瘤球細(xì)胞中陽(yáng)性表達(dá)，而在其分化后細(xì)胞中不表達(dá)，這些結(jié)果提示Sox2可能是宮頸癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子之一，其可能通過(guò)調(diào)控癌干細(xì)胞生長(zhǎng)而在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

3.2利用siRNA沉默Sox2的表達(dá)后，對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，采用基因沉默技術(shù)將shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入高表達(dá)Sox2基因的宮頸鱗癌C33A細(xì)胞中，并采用嘌呤霉素壓力篩選，成功構(gòu)建了穩(wěn)定下調(diào)Sox2基因的克隆細(xì)胞株shRNA-Sox2-C33A及其對(duì)照細(xì)胞shRNA-NC-C33A，經(jīng)qPCR方法檢測(cè)到Sox2在mRNA水平下調(diào)了60%左右。接著MTT實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明Sox2基因表達(dá)下調(diào)后，C33A細(xì)胞增殖速度明顯降低，體外平板克隆形成率下降。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果同Sox2在尤文肉瘤中的結(jié)果保持一致[10]，也首次在宮頸癌中表明Sox2起著一個(gè)原癌基因的角色，一旦在宮頸癌C33A細(xì)胞中沉默Sox2基因表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞的增殖和克隆形成能力。

3.3沉默Sox2對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖能力抑制的作用機(jī)制

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從上一有絲分裂結(jié)束到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束的全過(guò)程，包括靜止期(G0期)、DNA合成前期(G1期)、合成期(S期)、合成后期(G2期)及有絲分裂期(M期)。細(xì)胞進(jìn)程改變也是細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的重要原因，一旦細(xì)胞的正常周期程序不受控制，都將直接導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)行不可抑制的惡性增殖。在正常細(xì)胞周期中，CyclinD1與周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)4，6結(jié)合形成復(fù)合物后，并使CDK激活，從而磷酸化關(guān)鍵底物pRB(retinoblas￣toma protein，pRB)，促進(jìn)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞跨過(guò)G1/S期檢查點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)中，在高表達(dá)Sox2的宮頸癌C33A細(xì)胞中下調(diào)Sox2基因后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示干擾組shRNA-NC-C33A細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，而S期細(xì)胞減少，同時(shí)Western blot結(jié)果表明干擾組細(xì)胞CyclinD1表達(dá)下調(diào)，因此我們推測(cè)沉默Sox2基因表達(dá)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞C33A的增殖，這一作用可能是通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期素CyclinD1來(lái)阻滯G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖速度。這一實(shí)驗(yàn)同Oppel等[11]在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的結(jié)果一致，同時(shí)本研究結(jié)果也進(jìn)一步在宮頸癌中證明，沉默Sox2基因能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。

綜上所述，在宮頸癌C33A細(xì)胞中穩(wěn)定下調(diào)Sox2的表達(dá)，能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力，其可能通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1從而阻滯G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用。本研究為宮頸癌的發(fā)病機(jī)制及宮頸癌干細(xì)胞研究提供了新的線索，Sox2有望成為宮頸癌基因治療的新靶標(biāo)。

[1]Torre L A, Bray F, Siegel R L,etal. Global cancer statistics, 2012[J].CA Cancer J Clin,2015,65(2):87-108.

[2]Sarkar A, Hochedlinger K. The sox family of transcription factors: versatile regulators of stem and progenitor cell fate[J]. Cell Stem Cell, 2013,12(1):15-30.

[3]李雄武，張徽，柳滿然. Sox2下調(diào)表達(dá)對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞β-catenin與轉(zhuǎn)錄中介因子γ的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 38(1):55-61.

[4]Singh S, Trevino J, Bora-Singhal N,etal. EGFR/Src/Akt signaling modulates Sox2 expression and self-renewal of stem-like side-population cells in non-small cell lung cancer[J]. Mol Cancer, 2012,11:73.

[5]Ji J, Wei X, Wang Y. Embryonic stem cell markers Sox-2 and OCT4 expression and their correlation with WNT signal pathway in cervical squamous cell carcinoma[J].Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(5):2470-2476.

[6]Acanda de la Rocha A M, López-Bertoni H, Guruceaga E,etal. Analysis of SOX2-regulated transcriptome in glioma stem cells[J]. PLoS One, 2016,11(9):e0163155.

[7]Herreros-Villanueva M, Zhang J S, Koenig A,etal. SOX2 promotes dedifferentiation and imparts stem cell-like features to pancreatic cancer cells[J]. Oncogenesis, 2013,2:e61.

[8]Yang N, Wang Y, Hui L,etal. Silencing SOX2 expression by RNA interference inhibits proliferation, invasion and metastasis, and induces apoptosis through MAP4K4/JNK signaling pathway in human laryngeal cancer TU212 cells[J]. J Histochem Cytochem, 2015, 63(9):721-733.

[9]Yoon H I, Park K H, Lee E J,etal. Overexpression of SOX2 Is Associated with Better Overall Survival in Squamous Cell Lung Cancer Patients Treated with Adjuvant Radiotherapy[J].Cancer Res Treat, 2016,48(2):473-482.

[10]Ren C, Ren T, Kang Y,etal. Inhibition of SOX2 induces cell apoptosis and G1/S arrest in Ewing's sarcoma through the PI3K/Akt pathway[J]. J Exp Clin Cancer Res, 2016,35:44.

[11]Oppel F, Müller N, Schackert G,etal. SOX2-RNAi attenuates S-phase entry and induces RhoA-dependent switch to protease-independent amoeboid migration in human glioma cells[J]. Mol Cancer, 2011,10:137.