聚合酶鏈式反應技術及應用

摘要：指出了聚合酶鏈式反應是目前的一種最基本也是應用最廣泛的技術。由于PCR反應的快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點使其在短短的數(shù)年時間即被廣泛應用于各大領域。介紹了PCR反應的原理以及常用的PCR反應技術，探討了該技術在醫(yī)學、食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、農業(yè)中的運用，以期提供參考。

關鍵詞：聚合酶鏈式反應;技術;應用

中圖分類號：TS907

文獻標識碼：A

文章編號：16r 4-9944（2018）8-0230-02

1 引言

20世紀80年代中期，Mullis發(fā)明了體外核酸擴增技術——聚合酶鏈式反應，又稱PCR（ PolymeraseChain Reaction）反應。PCR反應是一種在生物體外模擬生物體內復制進行特定的DNA片段的放大擴增的分子生物學技術。PCR反應具有特異性強、靈敏度高、易重復、簡便、快速等突出優(yōu)點使其在短短的數(shù)年時間即被廣泛應用于各大領域如醫(yī)學診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品行業(yè)、農業(yè)、基因工程等。筆者將從PCR反應的原理、技術及應用方面進行綜述。

2 PCR反應的原理

DNA的半保留復制，具有高度的保真性，保證親代DNA和了代DNA具有相同的遺傳信息，為維持物種的穩(wěn)定性和連續(xù)性起著非常重要的作用。PCR反應的基本原理就是模擬DNA的體內復制過程進行DNA的體外擴增，通過設計特異性引物快速擴增所需的目的DNA序列。該技術是在模板DNA、dNTP mix、特異性引物、耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）和含Mg2+的緩沖液存在下的酶促反應，反應需在PCR儀中完成。PCR反應通常由變性、退火、延伸3個階段構成：①變性。酶促反應體系的溫度加熱至90～95℃，模板DNA雙鏈變性解離成單鏈DNA;②退火。溫度降至50～55℃，引物與單鏈DNA結合，形成局部雙鏈;③延伸。反應體系的溫度升高至72℃，以dNTP為原料，經熱穩(wěn)定的Taq酶的催化，合成一條與模板鏈互補的新DNA鏈。變性、退火、延伸這3個步驟就構成了PCR的一個循環(huán)，經過大概30個循壞。就可以將待擴增目的基因擴增數(shù)百萬倍以上。

3 常用的PCR反應技術

3.1 定量PCR技術

定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監(jiān)測，進行PCR起始模板量的定量[1]。目前，采用定量PCR方法主要包括半定量PCR、熒光定量PCR、定時定量PCR等。比如，可以借助半定量PCR技術分析目的基因在植物或者動物的不同組織和發(fā)育不同時期的表達情況，判斷該基因是組織特異性基因還是組成型基因，為基因功能的預測提供一定的基礎。

3.2 逆轉錄PCR（RT-PCR）技術

RT - PCR技術，將RNA的逆轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增反應（PCR）二者相結合在一起。以RNA為模板，經逆轉錄酶的催化合成cDNA，再以cD-NA為模板進行PCR反應。RT - PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于克隆mRNA的3和5的末端序列獲得基因的全場序列、檢測細胞或者組織中基因表達水平、測定細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等[2]。

3.3 巢式PCR技術

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應（PCR），區(qū)別于一般的PCR反應。它使用兩對PCR引物通過兩輪PCR反應（Outcr PCR和Inner PCR）擴增特異性的DNA片段。其中，第一對引物擴增片段和普通PCR相似，其擴增的產物為第二輪Inner PCR的模板。第二對引物為巢式引物，結合在第一輪PCR產物內部，使得第二輪Inner PCR擴增片段小于第一次擴增。例如，利用巢式PCR技術可以快速檢測到病料中的豬瘟病毒，在豬瘟的早期檢測及預防、控制上起到重要的作用[3]。

3.4 原位PCR技術

原位PCR技術是在原位雜交和PCR技術的基礎上發(fā)展起來的分子生物學技術。原位PCR技術可在組織切片或組織細胞里進行PCR反應，從而在細胞和分子水平上檢測到特定的基因序列，具有高度特異性、高度的敏感性和細胞定位準確的能力[4]。比如，在病理學領域，原位PCR技術不僅可以用于檢測細胞或者微生物病原的核酸，還可用于分析腫瘤、遺傳性疾病等內源基因的變化，以及跟蹤疾病與治療過程帶來的基因組改變，在分子水平上闡述疾病發(fā)生發(fā)展與致病因子之間的相互作用，在病理學研究與診斷中得到越來越廣泛的應用[5]。

3.5 多重PCR技術

多重PCR在同一個PCR反應系統(tǒng)中加入了兩對或兩對以上的寡核苷酸引物，并且同時能擴增出數(shù)量較多的核酸片段的PCR，其反應原理和操作過程一般與其他PCR相同[6]。

4 PCR反應技術的應用

4.1

PCR技術在醫(yī)學上的應用

PCR技術由于其突出的優(yōu)點，對腫瘤、遺傳病和感染性疾病的早期診斷，指導臨床治療和病情的觀察具有非常重要的意義。

4.1.1

Bart'S胎兒水腫綜合征

胎兒由于缺乏a珠蛋白基因表達，宮內嚴重貧血，多于孕晚期或出生后很快死亡。這種缺失型綜合征可用PCR鑒定基因擴增產物的有無進行基因的診斷，對Hb Bart's水腫胎早期流產，是重要預防出生缺陷的措施[7]。

4.1.2 甲型肝炎的診斷與預防

通過PCR技術擴增患者血液、尿液中甲型肝炎病毒（ HAV）特異性基因片段（HAV- RNA）來作為HAV鑒定和檢測診斷手段，能有效對甲型肝炎進行早期診斷以及預防其傳播流行。

4.2

PCR技術在食品工業(yè)中的應用

民以食為天，健康、放心、安全的食品是每一個人心中的夢想。傳統(tǒng)食品中微生物致病菌的檢測的步驟繁瑣費時，并對那些難以人工培養(yǎng)的微生物無法檢測。PCR技術剛好可以解決傳統(tǒng)微生物檢測所面臨的難題，檢測人員可以借助PCR反應檢測食品中的沙氏門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，讓人們的食品更加安全。

4.3

PCR技術在環(huán)境監(jiān)測中的應用

近年來隨著PCR技術應用的發(fā)展，對大氣、土壤、水等方面的環(huán)境監(jiān)測發(fā)揮著越來越重要的作用。譬如，用熒光定量PCR技術檢測環(huán)境激素一二惡英，其結果與其他生物學方法高度一致，并且靈敏、快速、經濟的特點可作為大量污染點和基層單位進行二惡英樣本的預篩手段[8]。

4.4

PCR技術在農業(yè)中的應用

PCR技術在農業(yè)中也有有非常廣泛的應用如轉基因產品檢測、作物的遺傳育種。植物從萌發(fā)到衰老整個生命周期除了可以看到的外在的因素的影響，電受到內在的因素基因的調控。研究整個周期過程基因表達的變化是揭示生長發(fā)育機理的重要手段。定量RTPCR是研究植物基因表達水平變化的一項重要技術。譬如，為了減少秋季低溫使得霜期提前，影響棉花的產量和晶質，人類一直在積極探索能夠促進植物早花的分子機理與機制。研究發(fā)現(xiàn)從棉花中克隆了一個成花素類似基因GhFTL1，通過對其功能進行初步分析，在擬南芥中組成型表達GhFTLl時，轉基因擬南芥開花比野生型明顯提早，為借助基因工程手段調控棉花的開花時間具有重要的理論指導意義[9]。

5 結論

隨著科學的不斷發(fā)展，PCR技術也在不斷創(chuàng)新與完善，它將滲透到生活的各個領域，人類將在農業(yè)、食品、醫(yī)藥、基因工程方而取得更大的突破！

參考文獻：

[1]劉黎紅.聚合酶鏈式反應技術的應用[J].農業(yè)與技術，2012（11）：9.

[2]趙紅慶，宛錫銅，黃留玉，多重PCR技術在病原檢測中的應用[J].生物技術通訊，2008，18（9）：863～865.

[3]魏淑英。張啟迪，劉煥奇，等.巢式PCR技術在豬瘟病毒檢測中的應用[J].畜禽業(yè)，2008（5）：6～8.

[4]吳文麟，黃東益，莊南生.原位PCR及其在植物研究中的應用[J].熱帶農業(yè)科學，2006，28（2）：65～69.

[5]陳超，高洪，趙寶洪.原位PCR技術及其在病理學上的應用[J].動物醫(yī)學進展，2007，28（5）： 95～97.

6]趙紅慶，宛錫銅，黃留玉，多重PCR技術在病原檢測中的應用[J].生物技術通訊，2008，18（9）：863～865.

[7]張金云，黃振勇，譚衛(wèi)荷，等.產前診斷——THAI型相關HbBart's水腫胎的臨床研究[J].中國優(yōu)生與遺傳雜志，2017，25（5）：85～86。

[8]孫晞.酶切保護PCR分析檢測環(huán)境中二英類化合物的方法學研究[D].武漢，華中科技大學同濟醫(yī)學院，2004.

[9]東銳，院海英，顧超，等.棉花GhFTLl基因的克隆及初步功能分析[J].棉花學報，2011， 23（6）：515～521.