內(nèi)生真菌苦馬豆素生物合成研究進(jìn)展

薩如拉 盧萍

摘要：指出了苦馬豆素（Swainsonine，SW）是一種有毒的吲哚里茲啶生物堿，含有sw的棘豆屬和黃芪屬植物統(tǒng)稱為瘋草，牲畜過(guò)量采食瘋草中毒.引起畜牧業(yè)的巨大損失。SW具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)的醫(yī)學(xué)作用.但人工合成sw價(jià)格較高，因此利用生物合成SW也有重要價(jià)值。從sw來(lái)源及理化性質(zhì)、作用機(jī)理、提取檢測(cè)方法，瘋草內(nèi)生真菌SW及其生物合成途徑研究進(jìn)展等方面進(jìn)行綜述，為明晰SW合成途徑、控制瘋草蔓延及發(fā)揮SW的醫(yī)療作用提供參考。

關(guān)鍵詞：瘋草內(nèi)生真菌;苦馬豆素;生物合成

中圖分類號(hào)：0629.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-9944（2018）8-0227-03

1 引言

瘋草（locoweeed）是含苦馬豆素（Swainsonine，SW）的棘豆屬（Oxytropis glabra DC.）和黃芪屬（Asr.ragalus）有毒植物的統(tǒng)稱[1]。SW是一種吲哚茲定生物堿，抑制動(dòng)物細(xì)胞a-甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ的活性[2]，引起低聚糖代謝和糖蛋白合成障礙，導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官功能紊亂。家畜過(guò)量采食含有SW的瘋草發(fā)生中毒，出現(xiàn)四肢麻痹、食欲不振、體重減少、流產(chǎn)等，嚴(yán)重者死亡，為畜牧業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失[3～5]。近年來(lái)對(duì)瘋草內(nèi)生真菌SW的研究越來(lái)越深入，已經(jīng)初步研究出sw在植物和瘋草內(nèi)生真菌中的合成機(jī)制，推測(cè)出sW合成部分途徑，其詳細(xì)未知。SW有良好的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，利用真菌合成有望提高SW的提取率[6]。

2 SW的性質(zhì)、作用機(jī)理及提取檢測(cè)

2.1 SW來(lái)源及其理化性質(zhì)

1979年Colegate等首次從灰苦馬豆中分離出有毒的三羥基吲哚茲定生物堿— SW[3]，SW化學(xué)式為C8H15NO3，分子量為173，熔點(diǎn)144℃～145℃，pKa為7.4，其純品為白色針狀晶體，易溶于水.不溶于乙醚、氯仿、和丙酮等有機(jī)溶劑。1982年美國(guó)學(xué)者M(jìn)olyneux從美國(guó)瘋草中分離得到sw，認(rèn)為在美國(guó)牲畜瘋草中毒主要由SW引起[7]。1989年我國(guó)學(xué)者曹光榮從黃花棘豆中分離得到SW[8]，2003年Braun等從美國(guó)斑莢膜黃芪（Astragalus mollissimus）、藍(lán)伯氏棘豆（Oxytropis Lambertii）和絹毛棘聶（Oxytropis sericea）三種瘋草中培養(yǎng)出埃里磚格孢屬內(nèi)生真菌（ Embellisia sp. L12，），并從該內(nèi)生真菌中分離出SW[9]，盧萍等從小花棘豆（ Oxytropis glabra））、刺葉柄棘豆（Oxytropis aciphylla）和砂珍棘豆（Oxytropis racemosa）單株植物巾提取sw，發(fā)現(xiàn)只有小花棘豆含SW，并植株體外分離得到內(nèi)生真菌，通過(guò)微生物學(xué)特征和5. 8SrDNA/ITS序列測(cè)序鑒定該內(nèi)生真菌為Embellisia，后修訂為Alternaria，而不含SW的小花棘豆都沒(méi)有內(nèi)生真菌，體內(nèi)有內(nèi)生真菌的小花棘豆產(chǎn)牛SW，提出小花棘豆的SW由內(nèi)生真菌合成[10，11]。此外，余永濤、王建華、路浩等從甘肅棘豆、冰川棘豆、莖直黃芪、青海瘋草中分離出了SW。

另外，Schneider等從豆類絲核菌、Hino等從金龜子綠僵菌中也分離到sw。

2.2

SW的機(jī)理

sw引起動(dòng)物瘋草病，它特異性抑制細(xì)胞溶酶體？一甘露糖苷酶和高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ的活性，使甘露糖苷酶與甘露糖的結(jié)合受阻，甘露糖蛋白代謝異常，引起神經(jīng)細(xì)胞的功能的紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞空泡化，從而牲畜出現(xiàn)巾毒癥狀，主要對(duì)牲畜巾樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)臟及骨骼肌等組織細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷，牲畜中毒給草原畜牧業(yè)帶來(lái)重大損失[3～5]。

SW有抗腫瘤活性，能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并提高機(jī)體免疫功能，使NK細(xì)胞和LAK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力顯著增強(qiáng)[6]。

2.3 SW的提取和檢測(cè)方法

1979年Colegate等利用乙酸乙酯索氏提取法首次提取到SW，溶液經(jīng)陽(yáng)離子交換柱層析，用氨水洗脫，收集濃縮后用氯化鈉梯度洗脫，氨水一氯仿抽提，回收后重結(jié)晶后得SW[3]。我國(guó)學(xué)者曹光榮從黃花棘豆中分離到SW，用鹽酸浸泡植物樣品粉末，濾液過(guò)離子交換柱層析，洗脫得sw[8]。盧萍等從小花棘豆內(nèi)生真菌中提取，利用乙酸一氯仿萃取、陽(yáng)離子交換層析純化得sw。目前檢測(cè)SW方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法及氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法及液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法、α-甘露糖苷酶活性抑制分析法等。

薄層色譜技術(shù)用于快速分離和定性分析未知化合物。SW是三羥基生物堿，對(duì)常規(guī)生物堿顯色劑反應(yīng)不靈敏、不易觀察其顏色，可用Erilich's試劑顯色法，將檢測(cè)樣品氧化后用醋酸酐處理加熱發(fā)生脫水反應(yīng)，形成不飽和鍵，與Erilich's試劑結(jié)合后生成便于觀察的紫紅色物質(zhì)[12]。

氣相色譜法流動(dòng)相為氣體，分離效率較高、分析速度較快、消耗樣品量少、應(yīng)用廣泛。保留時(shí)間是指被測(cè)樣品從進(jìn)樣至最大濃度值出現(xiàn)所需時(shí)間，依據(jù)保留時(shí)間出峰值位置進(jìn)行定性分析，依據(jù)保留時(shí)間峰面積進(jìn)行定量分析[13]。因?yàn)镾W在高溫下分解，不熊使用常規(guī)氣相色譜技術(shù)檢測(cè)，需在進(jìn)樣前進(jìn)行甲基化衍牛反應(yīng)，使之在高溫下穩(wěn)定后再檢測(cè)。

高效液相色譜法以液體為流動(dòng)相，靈敏度高、高效高速、定量準(zhǔn)確，與氣相色譜法基本原理方面相同，區(qū)別在于流動(dòng)相為液體，調(diào)整流動(dòng)相配較繁瑣，對(duì)層析柱要求較高[13]，用此法測(cè)定SW的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需進(jìn)行甲基化衍生。氣相色譜和液相色譜均能與質(zhì)譜聯(lián)用，進(jìn)行sw定性定量分析。

α- 甘露糖苷酶活性抑制分析法屬于酶標(biāo)分析法，α一甘露糖苷酶降解底物甘露糖苷，由于SW陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)與甘露糖苷陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)相似，SW與甘露糖苷酶親和力高，從而妨礙（α-甘露糖苷酶與底物的結(jié)合，該原理可間接測(cè)定SW含量[14]。盧萍課題組分別用氣相一質(zhì)譜聯(lián)用法、液相一質(zhì)譜聯(lián)用法、α-甘露糖苷酶活性抑制分析法測(cè)定了小花棘豆內(nèi)生真菌中sw的含量，重復(fù)性良好。

3 真菌SW生物合成途徑

3.1 豆類絲核菌的SW合成途徑

Broquist等從豆類絲核菌中分離出SW，該真菌可合成根霉菌胺及sw兩種生物堿[15]。Harris等推測(cè)豆類絲核菌中賴氨酸合成哌啶酸途徑：賴氨酸→酵母氨酸→L-2 -氨基己二酸半醛→1，6-二六氫吡啶羧酸（△1- piperideine -6 - carboxylate，P6C）→哌啶酸一朝。Wickwirc等提出P6C為哌啶酸的直接前體物，哌啶酸是sw的前體物，并推測(cè)出哌啶酸的合成途徑為L(zhǎng)一賴氨酸→酵母氨酸→P6C→吡啶酸：在酵母氨酸還原酶作用下賴氨酸形成酵母氨酸，在酵母氨酸還原酶作用下酵母氨酸形成L-2-氨基己二酸半醛，發(fā)生構(gòu)型改變生成P6C，1，6-二六氫哌啶酸還原酶作用下生成哌啶酸，與丙二酸反應(yīng)生成乙二酸哌啶，還原環(huán)化生成1—羧基吲哚里西啶，還原羥化生成1，2，8-三羥基吲哚里西啶，即SW[17]。

3.2 金龜子綠僵菌SW合成途徑

金龜子綠僵菌是昆蟲病原真菌，Sim等對(duì)金龜子綠僵菌合成SW機(jī)理進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加L-賴氨酸可增加哌啶酸的產(chǎn)量;添加賴氨酸相似物AEC時(shí)sw含量減少，酵母氨酸含量增多，菌體內(nèi)大量酵母氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橘嚢彼?，認(rèn)為L(zhǎng)-賴氨酸是哌啶酸的前體。推測(cè)sw生物合成時(shí)，L-賴氨酸在酵母氨酸還原酶作用下生成酵母氨酸，然后酵母氨酸在酵母氨酸氧化酶作用下，生成哌啶酸或α-酮戊二酸，經(jīng)一系列反應(yīng)生成α-氨基已二酸半醛，再通過(guò)非酶促環(huán)化反應(yīng)形成哌啶酸，最后轉(zhuǎn)化為sw[18]。

3.3 瘋草內(nèi)生真菌sw合成途徑

Mukhejee等敲除瘋草Undifilum內(nèi)生真菌的酵母氨酸還原酶基因，發(fā)現(xiàn)突變株中酵母氨酸和賴氨酸含量減少，而哌啶酸和sw含量增多，鑒于P6C是哌啶酸的直接前體，哌啶酸是SW的前體，推測(cè)SW生物合成途徑是：α-氨基己二酸→α一氨基己二酸半醛→P6C→哌啶酸→SW;同時(shí)，α-氨基己二酸半醛→酵母氨酸→賴氨酸，P6C與酵母氨酸之間可相互轉(zhuǎn)換[19]。

盧萍課題組克隆了小花棘豆內(nèi)生真菌酵母氨酸還原酶基因cDNA全長(zhǎng)序列（KJ944635）和該基因完整序列（KY052048），構(gòu)建酵母氨酸還原酶基因缺失突變株。在固體培養(yǎng)基巾添加α -氨基己二酸、L-賴氨酸和哌啶酸三種前體物，培養(yǎng)內(nèi)生真菌野生株和突變株，發(fā)現(xiàn)野生株的SW含量高于突變株;野生株中酵母氨酸含量比突變株高，而賴氨酸含量變化不明顯，賴氨酸促進(jìn)SW的合成;推測(cè)賴氨酸是生物體必需氨基酸，酵母氨酸是賴氨酸合成代謝途徑中間產(chǎn)物，酵母氨酸還原酶基因缺失后，突變株中酵母氨酸的合成受阻，可能從逆反應(yīng)方向進(jìn)行，即在酵母氨酸氧化酶的作用下由P6C轉(zhuǎn)化為酵母氨酸，然后生成賴氨酸，維持機(jī)體正常的牛命活動(dòng)，而P6C是SW合成前體，故突變株中sW的含量降低，而賴氨酸含量保持不變。添加前體化合物均可提高SW含量，其中哌啶酸對(duì)SW含量影響最大。

近期研究推測(cè)瘋草內(nèi)生真菌SW生物合成途徑有P6C途徑和P2C途徑[20，21]。在P6C途徑中，L-賴氨酸→酵母氨酸→α -氨基己二酸半醛→P6C，酵母氨酸還原酶催化以上三步反應(yīng)，P6C在吡咯啉-5-羧酸還原酶作用下生成哌啶酸，然后聚酮合酶催化其生成1-酮基—吲哚里西啶，再經(jīng)P450家族酶催化生成SW;P2C途徑是新近推測(cè)出的另一條SW生物合成途徑，由L-賴氨酸→α-己酮酸- P2C→哌啶酸→1-酮慕一吲哚里西啶→SW，無(wú)論是P6C還是P2C，都有許多未解之謎，需深入研究。

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