細(xì)菌和激素共暴露建立大鼠盆腔炎模型的方法

黃鳳珍 田貴華 劉敏 李玉桑 張煒 李小軍 唐瀟旖 唐和斌

摘要：建立一種大鼠的急、慢性盆腔炎癥模型，為評(píng)價(jià)盆腔炎藥物治療效果提供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物工具。采用了以下兩種方法：急性盆腔炙模型建立。將16只成年雌性SPF級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)均分為4組：正常組、大腸桿菌組、金黃色葡萄菌組、大腸桿菌和金黃色葡萄菌混合液組。三個(gè)模型組以雌二醇進(jìn)行預(yù)處理一周后，分別采用不同菌種定期染菌30天（1次/7天），并結(jié)合疲勞處理。檢測(cè)血清超氧化物歧化酶（Superoxide dis-mutase，S（）D）、丙二醛（ Malondialdehyde，MDA）的指標(biāo)。并采用HE染色觀察病理組織切片的形態(tài)學(xué)變化;慢性盆腔炎模型的建立。分組同上，接種50夭，檢測(cè)血清中SOD與MDA，HE染色以及免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)炎性因子環(huán)氧化酶2 （CUX-2）的含量。結(jié)果表明：急性盆腔炎模型實(shí)驗(yàn)中，臟器大體觀及組織病理檢查均表明正常組大鼠外陰部均無(wú)腫脹，附件臟器無(wú)明顯炎癥體征，而三種染菌模型組大鼠急性期外陰部腫脹，輸卵管、子宮內(nèi)膜、卵巢等附件臟器中出現(xiàn)炎癥、粘連、甚至糜爛;慢性盆腔炎模型實(shí)驗(yàn)中，三種染茵模型組大鼠的各附件臟器也出現(xiàn)炎癥、粘連、甚至糜爛，而且相應(yīng)組織中COX-2呈高度表達(dá)。通過(guò)簡(jiǎn)易的染菌方式成功制備大鼠的急性、慢性盆腔炎模型。

關(guān)鍵詞：盆腔炎;大腸桿菌;金黃色葡萄球菌;HE;環(huán)氧化酶—2

中圖分類(lèi)號(hào)：R711

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1674-9944（2018）8-0224-05

1 引言

盆腔炎是指女性內(nèi)生殖器官及周?chē)慕Y(jié)締組織、盆腔腹膜發(fā)生的炎癥[1]。盆腔炎為婦科常見(jiàn)病、難治病。嚴(yán)重者可引起敗血癥及膿毒血癥。如不及時(shí)控制，可出現(xiàn)感染性休克甚至死亡。但是，目前盆腔炎動(dòng)物模型與人疾病發(fā)生機(jī)制不吻合，發(fā)病機(jī)制不清，嚴(yán)重阻礙高效治療盆腔炎藥物的研發(fā)。

要研究人體盆腔炎的發(fā)生機(jī)制，首先要建立與其自然發(fā)生過(guò)程相似的動(dòng)物模型。目前公開(kāi)的盆腔炎動(dòng)物模型主要有：子宮內(nèi)膜炎模型和輸卵管炎模型。子宮內(nèi)膜炎模型主要是由苯酚膠漿劑、鹽酸或異物，通過(guò)化學(xué)燒傷、腐蝕或異物致炎而引起的，且方法過(guò)于強(qiáng)烈，同人體盆腔炎發(fā)生的自然過(guò)程不符合;輸卵管炎模型包括苯酚膠漿劑致大鼠輸卵管炎模型、兔溶血性鏈球菌感染性輸卵管炎模型、大鼠細(xì)菌感染性輸卵管炎模型[2]。這些方法同臨床盆腔炎發(fā)生也不相同，且手術(shù)難度較大，阻礙模型的應(yīng)用。臨床研究表明盆腔炎常見(jiàn)的致病因子為細(xì)菌（包括需氧菌和厭氧菌），也有病毒、霉菌、支原體、衣原體等。因此，本實(shí)驗(yàn)采用大腸桿菌、金黃色葡萄桿菌、混合菌液結(jié)合激素紊亂的造模法建立急性和慢性盆腔炎大鼠模型，測(cè)定大鼠血清MDA、SOD的含量變化以及采集各附件臟器標(biāo)本進(jìn)行組織病理學(xué)鏡檢。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性Wistar大鼠32只，體重200～220 g。購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[SCXK（鄂）2008 -0005]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及操作均獲中南民族大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審批許可后[ 2012 - SCUEC - AEC -002]，在巾南民族大學(xué)藥學(xué)院SPF級(jí)屏障實(shí)驗(yàn)設(shè)施中進(jìn)行[SYXK（鄂）2014 - 0078]。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。對(duì)小鼠的處理符合2006年中國(guó)科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[3]。

2.2 試劑與儀器

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色鏈球菌由武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心提供;牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（牛肉膏，蛋白胨，NaCI2，0.1 M NaOH，0.1 MHC1，0.1 M PBS）;蘇木精購(gòu)自南京建成科技有限公司;伊紅購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;多聚甲醛、無(wú)水乙醇、二甲苯購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。TP1020脫水機(jī)（德國(guó)Leica公司）;EG0050H石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）;RM2265切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）;ALC- 210.3型電子分析天平（德國(guó)Acculab公司）;Nikon50i顯微成像系統(tǒng)（口本Nikon公司）。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 菌液的配制

用適量的肉湯溶解凍干細(xì)菌后，移人5 mL肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃孵育箱培養(yǎng)2天，使細(xì)菌復(fù)活增殖。

2.3.2 動(dòng)物造模與分組

選用無(wú)生殖道疾病的雌性大鼠，在接種前，采用雌二醇（0.1 mL/100 g，2 mg/mL）金科藥業(yè)）處理1周。將大鼠在嚴(yán)格無(wú)菌的條件下采用1mL注射器將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和混合菌液于大鼠陰道中接種4周，每周2次。于第一次接種5周后，各組大鼠眼眶取血2 mL，注入潔凈的干燥試管中，待血液標(biāo)本自然凝固后，以3500 r/min速度離心10 min，提取血清，分裝入1.5 mLEP管中，置-80？ C超低溫冰箱中保存，用于血清MDA含量，SOD活力測(cè)定。經(jīng)取血后，快速脫臼處死動(dòng)物。打開(kāi)腹腔，并摘取生殖器官，如：陰道、子宮、輸卵管、卵巢，與無(wú)菌生理鹽水巾充分漂洗，固定48 h后用于病理學(xué)檢查。

2.3.3 大鼠血清MDA含量和SOD活力測(cè)定

（1）丙二酶（MDA）濃度測(cè)定方法。采用硫代巴比妥酸（ Thibabaturic，TBA）比色法，利用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)532 nm比色測(cè)定，試劑含量單位μmol/g。其測(cè)定原理為：過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532nm處有最大吸收峰。計(jì)算公式：血清中MDA含量=（測(cè)定組OD值一對(duì)照組OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)組OD值=空白組OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)，單位是nmol/mL。

（2）超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)定法：采用黃嘌呤氧化酶法，步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，試劑含量單位：nU/mg。其測(cè)定原理是：通過(guò)黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。當(dāng)被測(cè)樣品中含SOD時(shí)，SOD能夠催化超氧陰離子歧化，使形成亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管的吸光度值低于對(duì)照管的吸光度值，通過(guò)公式計(jì)算被測(cè)樣品中的SOD活力。按公式計(jì)算SOD的抑制率，SOD抑制率（%）=[（對(duì)照組一對(duì)照組空白）一（測(cè)定組一測(cè)定組空白）]/（對(duì)照組一對(duì)照組空白）×100%。血清中SOD活力（U/mL）=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0.24 mL/O.02 mL）×樣本測(cè)試的稀釋倍數(shù)。

2.3.4 病理觀察

切取所有實(shí)驗(yàn)組大鼠生殖器官，如：陰道，子宮，輸卵管，卵巢，4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片機(jī)制成3μm連續(xù)石蠟切片;同步烤片，然后脫蠟，梯度酒精水化，蘇木精—伊紅染色（hematoxylin and eo-sin，HE）染色。梯度酒精脫水，二甲苯透明，樹(shù)脂封片;光鏡下胞質(zhì)染為紅色，細(xì)胞核染為藍(lán)色。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0.1科學(xué)統(tǒng)計(jì)繪圖軟件進(jìn)行分析，并以x±s表示，組間比較采用雙向方差分析（ Two - way ANOVA），以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 革藍(lán)氏染色結(jié)果

以陰道涂片的方法觀察雌鼠不同發(fā)情周期陰道上皮細(xì)胞的變化類(lèi)型，并同時(shí)記錄其外陰部的特點(diǎn)，根據(jù)小鼠不同發(fā)情周期所表現(xiàn)出的陰部特點(diǎn)依次將其分為發(fā)情前期、發(fā)情期、間情期。在發(fā)情前期，可見(jiàn)白細(xì)胞游走;在發(fā)情期，則全是核化細(xì)，無(wú)白細(xì)胞、有核細(xì)胞;在發(fā)情間期，無(wú)白細(xì)胞游走，可見(jiàn)有核細(xì)胞、角化細(xì)胞。各周期的革蘭氏染色結(jié)果，見(jiàn)圖1（A）。模型制備期間，生理周期的檢測(cè)結(jié)果表明細(xì)菌接種引起大鼠生理周期的延長(zhǎng)或紊亂，考慮為炎癥所致。圖1（B）為陰道內(nèi)容物的革蘭氏染色結(jié)果。

3.2 大鼠急性、慢性盆腔炎模型血清中SOD和MDA的變化

在大鼠盆腔炎急性期造模過(guò)程中，相對(duì)于正常組，大腸桿菌組和混合菌組的SOD值均有所降低。大腸桿菌組、金色葡萄球菌組和混合菌組的MDA水平均顯著性高于正常組，分別是正常組的6.61倍、9.69倍以及6.37倍（P

在大鼠盆腔炎慢性造模過(guò)程中，相對(duì)于正常組，金色葡萄球菌組的SOD值顯著性下降（P<0.001）。大腸桿菌組、金色葡萄球菌組和混合菌組的MDA含量較前期有砦下降但仍高于對(duì)照組。金色葡萄球菌組和混合菌組SOD/MDA的比值與正常組相比，顯出特異性低下。以上數(shù)據(jù)表明三個(gè)模型組處于炎癥期，說(shuō)明本次大鼠慢性盆腔炎模型炎癥狀態(tài)形成（表2）。

3.3 大鼠生殖器組織的肉眼和病理觀察

大鼠生殖器組織標(biāo)本的肉眼觀察，正常組盆腔臟器表面無(wú)充血、水腫或粘連。輸卵管無(wú)腫脹，管壁彈性未發(fā)生改變。急性期造模中，模型組接種后第3天發(fā)現(xiàn)外陰部紅腫，分泌物增多。接種第30天，模型組外陰可見(jiàn)明顯腫脹和炎性分泌物，其中金黃色葡萄球菌組最為明顯。解剖后可見(jiàn)模型組陰道腫脹，子宮充血積液，卵巢出現(xiàn)明顯的囊泡，整體硬度顯著增大，且與周?chē)鞴俳M織黏連難分離。其中大腸桿菌組輸卯管和子宮呈現(xiàn)嚴(yán)重腫大，金色葡萄球菌組次之。慢性期造模中，接種第50天，模型組外陰可見(jiàn)少量炎性分泌物。相對(duì)急性期，其外陰腫脹程度和分泌物數(shù)量有所減少。解剖前后體征對(duì)照比較，大腸桿菌組肉眼可見(jiàn)腹腔下部充血，子宮、輸卵管明顯增粗、腫脹，盆腔廣泛粘連不易分離。金色葡萄球菌組肉眼可見(jiàn)子宮大量積液，擴(kuò)張的子宮、輸卵管有膿一樣粘稠物質(zhì)?；旌暇M肉眼可見(jiàn)子宮、輸卵管腫脹變硬，與內(nèi)在臟器粘連，特別是卵巢部位出現(xiàn)明顯囊泡，考慮為炎性表征。三個(gè)模型組的大鼠的直腸附近出現(xiàn)局部血腫塊（圖2、圖3）。

光鏡下觀察，正常組間皮細(xì)胞呈單層扁平，核旱扁圓形，位于細(xì)胞中央。輸卵管壁組織結(jié)構(gòu)清晰，管腔通暢，黏膜上皮呈柱狀，纖毛存在。急性期造模中，大腸桿菌組明顯可見(jiàn)子宮黏膜上皮明顯壞死變性，肌層和固有層均有明顯結(jié)締組織增生和炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肌層排列紊亂，管腔有一定的粘連阻塞，漿膜層有散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)。金色葡萄球菌組出現(xiàn)輸卵管管腔擴(kuò)大，黏膜皺壁和肌層充血，水腫，黏膜乳頭增生，互相粘合成網(wǎng)狀，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)?；旌暇M附件組織中上皮細(xì)胞壞死，大量炎性細(xì)胞伴充血水腫。官腔上皮破壞，粘膜下充血，水腫，大量的中性粒細(xì)胞呈局部灶浸潤(rùn)，腺體破壞，失去正常結(jié)構(gòu)。慢性期造模中，大腸桿菌組，金色葡萄球菌組和混合菌組均不間程度地出現(xiàn)明顯的子宮粘連、炎癥浸潤(rùn)、黏膜層水腫、腺體破壞或減少等變化，與人類(lèi)慢性盆腔炎疾病表現(xiàn)相似（圖2、圖3）。

3.4 慢性盆腔炎大鼠子宮附件中環(huán)氧化酶-2的高度表達(dá)

將接種50天的大鼠處死后，取子宮及子宮附件組織石蠟包埋后切片后，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，染色結(jié)果如圖4所示。正常組的COX-2表達(dá)不明顯，大腸桿菌組卵巢內(nèi)具有豐富的血管、炎性細(xì)胞中COX-2蛋白高表達(dá);子宮粘膜層到漿膜層內(nèi)大量炎性細(xì)胞中C（）X-2蛋白高表達(dá);輸卵管及其周?chē)M織炎性細(xì)胞中COX-2蛋白高表達(dá)。金黃色葡萄球菌組子宮上皮層至肌層漿細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等慢性炎細(xì)胞侵入?；旌暇M輸卵管及其周?chē)M織炎性細(xì)胞中COX-2蛋白高表達(dá)說(shuō)明該造模方式會(huì)引起體內(nèi)炎性因子的大量分泌，與臨床相符。

4 討論

盆腔炎是指女性生殖器官及周?chē)慕Y(jié)締組織、腹膜發(fā)生炎癥，包括子宮內(nèi)膜炎、輸卵管炎、卵巢炎、附件炎等[4，5]。根據(jù)其病程經(jīng)過(guò)，盆腔炎分為急性盆腔炎和慢性盆腔炎。盆腔炎往往是由需氧菌和厭氧菌混合感染引起的，其中常見(jiàn)的致病體有鏈球菌、淋球菌、支原體、衣原體、葡萄球菌、大腸桿菌、厭氧菌及性傳播等病原體[6]。革蘭陽(yáng)性的葡萄球菌是產(chǎn)后、手術(shù)后、生殖器炎癥及傷口感染常見(jiàn)的致病菌。大腸埃希菌是腸道及陰道的正常寄生菌，一般不致病，但當(dāng)機(jī)體極度衰弱及生殖道有損傷時(shí)可引起嚴(yán)重感染。本研究選擇了上述兩種細(xì)菌作為研究對(duì)象。

傳統(tǒng)造模方法即將苯酚膠漿或鹽酸作為致炎劑注人大鼠的一側(cè)子宮或輸卵管，大鼠順應(yīng)性差，組織損傷嚴(yán)重，死亡率高。在本實(shí)驗(yàn)小，通過(guò)將大腸桿菌或金黃色葡萄球菌經(jīng)陰道給藥，增加了小鼠服藥的順應(yīng)性，致炎途徑及病變機(jī)制接近于臨床盆腔炎的發(fā)生與病變。接種30天時(shí)，大腸桿菌組、金黃色葡萄球菌組和混合菌組大鼠的外陰和盆腔附件臟器可見(jiàn)明顯腫脹或炎性分泌物，特別是模型組卵巢部位明顯囊泡，考慮為炎性表征。其中，混合菌組的附件臟器糜爛程度最為嚴(yán)重，即長(zhǎng)期陰道給予細(xì)菌混合液能更好地建立急性盆腔炎模型。

SOD是人體內(nèi)清除氧自由基的主要抗氧化酶之一，在細(xì)胞內(nèi)和各種體液中廣泛分布，因此血清SOD水平反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。研究表明盆腔炎的病理生理過(guò)程均與SOD的代謝失常有關(guān)[7]，盆腔炎患者因長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)，體內(nèi)氧自由基生成過(guò)多，因此血清SOD活性下降、水平降低。慢性炎癥時(shí)出現(xiàn)氧自由基形成和清除失衡，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，而MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，直接反映組織中氧自由基引起的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的程度，也可間接反映細(xì)胞損傷的程度[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，解剖后血樣中SOD、MDA含量的檢測(cè)，結(jié)果表明大腸桿菌組、金黃色葡萄球菌組和混合菌組的MDA含量特異性增高，且三個(gè)模型組的SOD/MDA的比值與正常組相比，顯出特異性低下。表明本次急性造模成功。

環(huán)氧化酶-2（COX -2）是炎癥相關(guān)因子，與機(jī)體損傷及炎癥的發(fā)生有密切聯(lián)系[9，10]。在本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)附件臟器的切片進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色以觀察COX-2的表達(dá)變化。在給予激素刺激和細(xì)菌感染的基礎(chǔ)上，相對(duì)于正常組，模型組中子宮粘膜層到漿膜層、卵巢、輸卵管及其周?chē)M織內(nèi)大量炎性細(xì)胞中COX -2蛋白高表達(dá)。由此可見(jiàn)，該造模方式不僅引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物盆腔組織外觀的變化，也極大地刺激了體內(nèi)的炎癥因子的高度表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)立了陰道給予大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和混合菌50天模擬臨床上由急性期遷延為慢性期的盆腔炎。50天后，大腸桿菌組、金黃色葡萄球菌組和混合菌組在直腸附近出現(xiàn)局部血腫塊。與急性盆腔炎的模型組相比，外陰腫脹消退。腸桿菌組、金黃色葡萄球菌組和混合菌組的附件臟器均可見(jiàn)細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)及組織結(jié)構(gòu)紊亂。血清中的SOD/MDA的比值相對(duì)于空白組顯著性降低。表明采用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌建立慢性盆腔炎模型成功。

理想的盆腔炎動(dòng)物模型應(yīng)與人類(lèi)大多數(shù)盆腔炎病理組織類(lèi)型相一致，具有相似的致病菌、感染因素、感染途徑、病變特點(diǎn)以及操作簡(jiǎn)便、復(fù)制迅速、成功率高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用大鼠，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為致炎劑，通過(guò)陰道給藥，先后在30天、50天時(shí)成功建立了大鼠的急性、慢性盆腔炎模型。本實(shí)驗(yàn)的盆腔炎模型采用了需氧細(xì)菌，雖未考慮其他致病因子，如厭氧菌、病原體、病毒等，但目前模型建立的成功率高（近100%），不依賴免疫抑制劑。操作方法簡(jiǎn)單易行，材料易得，方法易掌握，對(duì)使用者無(wú)特殊技術(shù)要求，并符合盆腔炎臨床自然發(fā)生病理特點(diǎn)，適用于盆腔炎發(fā)生、發(fā)展及其機(jī)制的研究和相關(guān)藥物的篩選。

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