細胞因子和免疫球蛋白抗體在過敏性鼻炎小鼠早期無癥狀階段和晚期有癥狀階段表達的差異

楊 軍 王 敏 張 羅,2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 教育部耳鼻咽喉頭頸科學(xué)重點實驗室 鼻病研究北京市重點實驗室,北京 100730；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院鼻過敏科，北京 100730)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是一種由接觸過敏原所導(dǎo)致的以打噴嚏、鼻癢、鼻堵和流鼻涕為主要癥狀的疾病。AR是最常見的過敏性疾病之一，世界范圍內(nèi)的發(fā)病率最高可達40%，且有逐年上升的趨勢[1-2]。

Th2反應(yīng)和過敏原特異性IgE的生成是AR的主要特征[3-4]。除此之外，很多因子參與了AR的發(fā)生。以往研究[5-10]報道過敏原特異性IgG1和IgG2a抗體的生成[5]、Th17細胞因子白細胞介素(interleukin-17，IL-17)[6-8]和前炎性反應(yīng)因子IL-6[9-10]參與了AR的發(fā)病。AR的發(fā)病是個動態(tài)過程，在早期臨床過敏癥狀出現(xiàn)之前已發(fā)生了多種免疫反應(yīng)，上述免疫因子在此階段變化如何，以及與過敏癥狀的關(guān)系如何，目前尚不清楚。

本研究通過建立卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘導(dǎo)的AR小鼠模型觀察激發(fā)早期和激發(fā)晚期上述細胞因子和免疫球蛋白抗體表達的差異，以探討AR早期無癥狀階段和晚期有癥狀階段上述免疫反應(yīng)的異同，這將有助于對AR發(fā)病機制的理解。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c雄性小鼠，7～8周齡，體質(zhì)量20～25 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供，實驗動物合格證號：SCXK(京)2016-0010。

1.2 OVA-誘導(dǎo)的AR小鼠模型的建立及實驗方案

用BALB/c小鼠進行AR 動物模型的建立，具體建模方案同參考文獻[11]。簡單過程為在第1天和第7天用含50 μg OVA和5 mg Al(OH)3的400 μL 0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液溶液進行致敏性腹腔內(nèi)注射; 14 d后連續(xù)3周每周3 d鼻局部給予含50 μg OVA的 0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液溶液20 μL進行激發(fā)。采用數(shù)字表法將實驗動物隨機分為3組，對照組、激發(fā)早期組和激發(fā)晚期組。對照組為用 0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液代替OVA致敏和激發(fā)，在第30天 0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液激發(fā)結(jié)束后2 h處理6只小鼠；激發(fā)早期組為在第16 天OVA激發(fā)結(jié)束后2 h處理6只小鼠；激發(fā)晚期組為在第30 天OVA激發(fā)結(jié)束后2 h處理6只小鼠。收集血清和鼻黏膜，鼻黏膜用于提取RNA，血清用于細胞因子和免疫球蛋白抗體檢測，詳見圖1。

1.3 鼻部過敏癥狀的檢測

最后一次激發(fā)后，立即計數(shù)20 min內(nèi)撓鼻和噴嚏的次數(shù)，然后取平均值。

1.4 血清 OVA特異性IgE和IgG抗體檢測

血清OVA特異性IgE、IgG1和IgG2a抗體用ELISA法檢測，具體方法參考文獻[12]。96孔板用100 μL 10 g/L OVA包被，4 ℃過夜，然后用含4%(質(zhì)量分數(shù))BSA 的 PBS室溫封閉1 h。加入100 μL血清樣品室溫孵育2 h，用含0.05%(體積分數(shù))Tween 20的PBS 洗滌后，然后加入辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IgE (1∶4 000)、IgG1 (1∶5 000)或IgG2a (1∶5 000) (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, 美國) 室溫孵育2 h。洗滌后用100 μL四甲基聯(lián)苯胺(Sigma-Aldrich)顯色。

圖1 AR小鼠模型的建立和實驗方案Fig.1 AR mouse model and experimental protocolAR: allergic rhinitis.

1.5 Real-time PCR檢測

用Trizol(Invitrogen公司., 美國)提取鼻黏膜組織總RNA，Oligo(dt)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后用Real-time PCR法檢測鼻黏膜干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)，IL-4，IL-17和IL-6基因表達。所用染料為Platinum SYBR Green q PCR SuperMixUDG，購自美國Invitrogen公司，儀器為Rotor-GeneTM6200 HRM (Corbett Life Science, 澳大利亞)。引物序列見表1。結(jié)果用Delta Delta Ct法分析。

1.6 血清細胞因子檢測

血清細胞因子用小鼠Th1/Th2/Th17 cytometric bead array kit (BD PharMingen, La Jolla, CA, 美國) 檢測。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠鼻部癥狀比較

撓鼻和打噴嚏是過敏性鼻炎的主要癥狀。撓鼻和打噴嚏次數(shù)在晚期激發(fā)組顯著高于早期激發(fā)組和

對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。但在早期激發(fā)組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

2.2 血清OVA-特異性IgE、IgG1和IgG2a濃度

血清OVA-特異性IgE, IgG1和IgG2a濃度在早期激發(fā)組和晚期激發(fā)組均顯著增高，且過敏原特異性IgG1和IgG2a在晚期激發(fā)組顯著高于早期激發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3)。

2.3 鼻黏膜IFN-γ、L-4、IL-17和IL-6基因的表達

鼻黏膜IFN-γ基因(Th1因子)在3組間表達，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-4基因(Th2因子)在晚期激發(fā)組表達顯著高于對照組；IL-17(Th17細胞因子)和前炎性因子IL-6基因在早期激發(fā)組和晚期激發(fā)組表達均顯著增高，且在晚期激發(fā)組的表達顯著高于早期激發(fā)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.4 血清IFN-γ、L-4、IL-17和IL-6蛋白的表達

血清Th1因子IFN-γ在3組間表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Th2因子IL-4在晚期激發(fā)組表達顯著高于對照組和早期激發(fā)組；Th17細胞因子IL-17和前炎性因子IL-6在早期激發(fā)組和晚期激發(fā)組小鼠均顯著增高，且在晚期激發(fā)組的表達顯著高于早期激發(fā)組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5)。

表1 實時定量PCR引物序列Tab. 1 Primers used for quantitative real-time PCR

IL:interleukin;IFN:interferon.

圖2 3組小鼠鼻部癥狀比較Fig.2 Comparison of the nasal symptoms among three groupsA：nasal rubbing; B:sneeze.

圖3 血清OVA-特異性IgE, IgG1和IgG2a濃度Fig.3 Serum OVA-specific IgE, IgG1 and IgG2aA：OVA-specifie IgE；B：OVA-specifie IgG1；C：OVA-specifie IgG2a；OVA：ovalbumin.

圖4 鼻黏膜IFN-γ, IL-4, IL-17和IL-6基因的表達Fig.4 Gene expression of cytokines in nasal mucosaA:IFN-γ; B:IL-4;C:IL-17;D:IL-6; IFN:interferon; IL:interleukin.

3 討論

Th2、Th17反應(yīng)和過敏原特異性IgE、IgG1和IgG2a的生成與AR有關(guān)，但是這些免疫因子是否參與了AR早期無癥狀階段免疫反應(yīng)，及與臨床過敏癥狀的關(guān)系如何，目前尚不清楚。為了探討此問題，本研究觀察了OVA誘導(dǎo)的AR小鼠激發(fā)早期和晚期階段鼻部過敏癥狀和這些免疫因子表達的變化。

本研究中OVA誘導(dǎo)AR小鼠模型激發(fā)早期階段沒有出現(xiàn)鼻部過敏癥狀，激發(fā)晚期階段出現(xiàn)明顯的鼻部過敏癥狀，所以用此激發(fā)早期和晚期階段分別代表AR早期無癥狀和AR晚期有癥狀階段。AR主要是Th2反應(yīng)[12]，本研究證實激發(fā)晚期有癥狀階段鼻黏膜IL-4基因表達和血清IL-4水平均顯著增高。盡管血清IL-4水平在激發(fā)晚期顯著高于激發(fā)早期和對照，但鼻黏膜IL-4基因表達無此趨勢，因此IL-4與過敏癥狀出現(xiàn)的是否有關(guān)還有待進一步證實。鼻黏膜IFN-γ基因表達和血清IFN-γ蛋白水平在激發(fā)早期和晚期階段均未出現(xiàn)顯著變化，提示Th1反應(yīng)與AR早期無癥狀和晚期有癥狀階段均無關(guān)。

圖5 血清IFN-γ, IL-4, IL-17和IL-6蛋白的表達Fig.5 Protein expression of cytokine in SerumA:IFN-γ; B:IL-4;C:IL-17;D:IL-6; IFN:interferon; IL:interleukin.

過敏原特異性IgE的生成是AR的主要特征之一，有研究[13]顯示IgE的致敏程度和過敏癥狀出現(xiàn)的風(fēng)險呈正比。本研究發(fā)現(xiàn)OVA-特異性IgE在AR早期沒有出現(xiàn)癥狀前也顯著升高，但在早期無癥狀階段和晚期有癥狀階段差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，因此不能證明過敏癥狀與過敏原特異性IgE有關(guān)。與以往研究[5]一致，本研究結(jié)果顯示OVA-特異性IgG1和IgG2a在AR晚期有癥狀階段顯著增高；而且這兩種免疫球蛋白抗體在早期無癥狀階段即有顯著增高，盡管顯著低于晚期有癥狀階段。這些結(jié)果表明OVA-特異性IgG1和IgG2a可能參與了AR早期無癥狀階段的反應(yīng)，且可能與鼻部過敏癥狀的出現(xiàn)有關(guān)。

以往研究[9-10]顯示前炎性因子IL-6參與了AR的發(fā)生。本研究中，IL-6在AR早期無癥狀階段和晚期有癥狀階段均顯著增高，且晚期有癥狀階段顯著高于早期無癥狀階段，提示IL-6可能參與了AR早期無癥狀階段的反應(yīng)，且其表達水平可能與過敏癥狀的出現(xiàn)有關(guān)。然而，IL-6是一種多功能的細胞因子，由多種細胞(如抗原提呈細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、單核細胞和巨噬細胞)在多種刺激下生成。因此，IL-6如何影響過敏癥狀的發(fā)生還有待進一步研究。

IL-17(也稱為IL-17A)是IL-17家族的一員，主要由Th17細胞亞群生成[14]。有研究[15]顯示IL-17缺陷小鼠的過敏癥狀、血清IgE、嗜酸浸潤、組胺和白三烯的釋放均顯著降低，說明IL-17參與了AR的發(fā)生。本研究中，激發(fā)早期階段鼻黏膜IL-17基因表達和血漿IL-17濃度顯著升高，提示IL-17可能也參與了AR早期無癥狀階段的反應(yīng)。有研究[8]報道血清IL-17濃度與臨床癥狀有關(guān)，與此一致，本研究發(fā)現(xiàn)鼻黏膜IL-17基因表達和血漿IL-17濃度在激發(fā)晚期階段顯著高于激發(fā)早期階段，這些證據(jù)支持IL-17表達可能與過敏癥狀有關(guān)。IL-17與IL-6表達趨勢相似，而IL-6的功能之一是促進Th17細胞的分化和IL-17的生成[16-17]，因此IL-6與過敏癥狀的關(guān)系可能是通過促進IL-17生成發(fā)揮作用。

總之，本研究結(jié)果提示IL-17、IL-6和過敏原特異性IgG1和IgG2a抗體可能參與了AR早期無癥狀階段的反應(yīng)，且其表達水平可能與過敏癥狀的出現(xiàn)有關(guān)。

[1] Bousquet J, Khaltaev N, Cruz A A,et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) 2008 update (in collaboration with the World Health Organization, GA(2)LEN and AllerGen)[J].Allergy, 2008,63(Suppl 86):8-160.

[2] Wang X D, Zheng M, Lou H F,et al. An increased prevalence of self-reported allergic rhinitis in major chinese cities from 2005 to 2011[J]. Allergy, 2016,71(8):1170-1180.

[3] Hansen I, Klimek L, M?sges R, et al. Mediators of inflammation in the early and the late phase of allergic rhinitis[J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2004,4(3):159-163.

[4] Dullaers M, De Bruyne R, Ramadani F, et al. The who, where, and when of IgE in allergic airway disease[J]. J Allergy Clin Immunol,2012,129(3):635-645.

[5] Cho K S, Park H K, Park H Y, et al. IFATS collection:Immunomodulatory effects of adipose tissue-derived stem cells in an allergic rhinitis mouse model[J]. Stem Cells, 2009,27(1):259-265.

[6] Semik-Orzech A, Barczyk A, Wiaderkiewicz R, et al. Interleukin 17 and RANTES levels in induced sputum of patients with allergic rhinitis after a single nasal allergen challenge[J]. Ann Allergy Asthma Immunol, 2009,103(5):418-424.

[7] Ciprandi G, Fenoglio D, De Amici M, et al. Serum IL-17 levels in patients with allergic rhinitis[J]. J Allergy Clin Immunol, 2008,122(3):650-651.e2.

[8] Ciprandi G, De Amici M, Murdaca G, et al. Serum interleukin-17 levels are related to clinical severity in allergic rhinitis[J]. Allergy, 2009,64(9):1375-1378.

[9] Petti F B,Liguori A, Ippoliti F. Study on cytokines IL-2, IL-6, IL-10 in patients of chronic allergic rhinitis treated with acupuncture[J]. J Tradit Chin Med, 2002,22(2):104-111.

[10] Hsueh K C, Lin C Y, Lin Y J. Serum levels of resistin in allergic rhinitis and its relationship with disease severity[J]. Am J Rhinol Allergy, 2009,23(4):365-369.

[11] Wang M, Zhang W, Shang J, et al.Immunomodulatory effects of IL-23 and IL-17 in a mouse model of allergic rhinitis[J]. Clin Exp Allergy, 2013,43(8):956-966.

[12] Galli S J, Tsai M, Piliponsky A M. The development of allergic inflammation[J]. Nature, 2008,454(7203):445-454.

[13] Bousquet J, Anto J M, Bachert C, et al. Factors responsible for differences between asymptomatic subjects and patients presenting an IgE sensitization to allergens. A GA2LEN project[J].Allergy,2006,61(6):671-680.

[14] Iwakura Y, Ishigame H, Saijo S, et al. Functional specialization of interleukin-17 family members[J]. Immunity, 2011,34(2):149-162.

[15] Braunstahl G J, Fokkens W J, Overbeek S E, et al. Mucosal and systemic inflammatory changes in allergic rhinitis and asthma: a comparison between upper and lower airways[J]. Clin Exp Allergy, 2003,33(5):579-587.

[16] Burgler S, Ouaked N, Bassin C, et al. Differentiation and functional analysis of human T(H)17 cells[J]. J Allergy Clin Immunol, 2009,123(3):588-595, 595.e1-7.

[17] 馬思琪, 閆宇,佟鳳嬌,等.白細胞介素-17A誘導(dǎo)脂肪細胞中炎癥因子表達[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2017，20(2)：186-189.