NOS2基因單核苷酸多態(tài)性與單純塵螨過敏性鼻炎相關(guān)性研究

李景云 張 媛 張 羅， 2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 教育部耳鼻咽喉頭頸科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鼻病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院鼻過敏科，北京 100730)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis， AR)是由IgE介導(dǎo)的鼻黏膜炎性反應(yīng)，是耳鼻咽喉科的常見病、多發(fā)病，已成為全球性的公共健康問題。AR在全世界范圍的發(fā)病率為23%，我國中心城市的自報(bào)患病率為8.7%～24.1%[1]。AR是一種復(fù)雜性疾病，受遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響。研究[2]顯示，一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種高脂溶性小分子氣體，既可參與鼻黏膜免疫功能，又可作為非腎上腺素能非膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)參與對鼻黏膜血管的調(diào)節(jié)，還具備調(diào)控鼻黏膜纖毛運(yùn)動的功能，從而參與AR發(fā)病過程。其中，一氧化氮合成酶2(nitric oxide synthase 2， NOS2)是NO生成過程中的關(guān)鍵酶，對產(chǎn)生和維持高濃度的NO尤為重要。本研究通過檢測單純塵螨過敏性鼻炎(house dust mite-sensitive allergic rhinitis，HDM-sensitive AR)患者NOS2基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism， SNP)改變，從而分析其與AR易感性之間的關(guān)系。此外，通過測定患者血清總IgE濃度，并分析其與NOS2基因多態(tài)性的關(guān)系，以了解變應(yīng)性因素與NOS2基因多態(tài)性有無關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

根據(jù)我國AR診斷和治療指南[3]，選取2010年2月至2012年2月間就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院AR診療中心的單純塵螨(屋塵螨和粉塵螨)AR患者385例，其中男性173例，女性212例，年齡4～71歲，年齡中位數(shù)為26歲；同時(shí)募集健康對照受試者424例，其中男199例，女225例，年齡18～80歲，年齡中位數(shù)為35歲。所有AR患者均出現(xiàn)鼻塞、清水樣涕、鼻癢和噴嚏癥狀中2項(xiàng)或2項(xiàng)以上；查體可見鼻黏膜蒼白、水腫和清水樣分泌物；變應(yīng)原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(skin prick test， SPT)單純塵螨陽性，且每當(dāng)有塵螨暴露史，均出現(xiàn)鼻腔癥狀。所有健康對照受試者均無鼻腔癥狀，SPT試驗(yàn)陰性，且吸入性過敏原過篩試驗(yàn)陰性。本研究所有入選者均為北京地區(qū)居住的中國漢族人群，均不伴有其他過敏性疾病如哮喘、特應(yīng)性皮炎等。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(批準(zhǔn)文號：V20100207.0)審議通過，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1)SPT試驗(yàn)：SPT試驗(yàn)及分級方法參照以往文獻(xiàn)[4]進(jìn)行，所有AR入選者單純塵螨陽性，且SPT分級結(jié)果≥1級。2)血清IgE檢測：血清IgE檢測使用UniCAP100檢測系統(tǒng)(瑞典法瑪西亞公司)。3)基因組DNA提?。翰杉茉囌咧忪o脈血5 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管暫存于-20℃，DNA提取按照基因組DNA提取試劑盒(Roche公司，美國)操作說明進(jìn)行，-80℃凍存?zhèn)溆谩?)SNP位點(diǎn)選擇：參考Hapmap網(wǎng)站提供的中國北京地區(qū)人群(CHB)覆蓋候選基因范圍內(nèi)的標(biāo)簽SNP信息(Hapmap第Ⅱ+Ⅲ階段2009年2月數(shù)據(jù)，http://www.hapmap.org)[5]，并利用Haploview 4.1軟件[6]將Hardy-WeinbergP值，劣勢等位基因頻率(minor allele frequency， MAF)及r2分別設(shè)置為0.01、0.05及0.8，進(jìn)而得到代表NOS2基因的標(biāo)簽SNP位點(diǎn)，即rs2297516、rs7406657、rs3794764、rs2872753、rs2779249和rs3794766共計(jì)6個(gè)位點(diǎn)。5)SNP分型：選擇MassARRAY實(shí)驗(yàn)平臺(美國Sequenom公司)實(shí)現(xiàn)SNP分型檢測，將點(diǎn)好樣品的芯片放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測分析，利用Typer 4.0軟件檢測質(zhì)譜峰，并根據(jù)質(zhì)譜峰圖判讀各樣本目標(biāo)位點(diǎn)基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)特征

AR患者組與正常對照組在性別組成上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.325，P=0.569)，而AR組平均年齡顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-11.474，P<0.001)。

2.2 個(gè)體SNP相關(guān)性分析

1)Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)：所有候選位點(diǎn)均通過Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P>0.01)并用于后續(xù)的遺傳相關(guān)性分析。

2)等位基因頻率差異比較：單位點(diǎn)相關(guān)性分析顯示NOS2基因上的6個(gè)SNPs等位基因頻率在AR患者組與正常對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

3)基因型分布比較：采用Logistic回歸分析，在劣勢等位基因顯性遺傳模型下，經(jīng)校正年齡和性別混雜因素后，結(jié)果顯示，6個(gè)SNPs位點(diǎn)中，僅rs3794764位點(diǎn)的基因型分布在AR患者組和正常對照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.047)；rs3794764的AA+AG基因型相對GG基因型是AR的危險(xiǎn)因素(OR=1.413，95%CI：1.005-1.987)，具體結(jié)果詳見表2。

4)連鎖不平衡(linkage disequilibrium， LD)分析及單倍型構(gòu)建：LD分析結(jié)果顯示6個(gè)候選SNPs位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡(圖1)。

5)單倍型分析：單倍型分析未見任何一組單倍型與AR發(fā)生相關(guān)，具體結(jié)果詳見表3。

2.3 NOS2基因SNPs與血清總IgE濃度的相關(guān)性分析

采用多元線性回歸分析，在劣勢等位基因顯性遺傳模型下，經(jīng)校正年齡和性別混雜因素后，結(jié)果顯示，在健康對照人群中，rs3794766位點(diǎn)的TT+CT基因型血清總IgE(Log轉(zhuǎn)化后)濃度(1.646±0.045)ku/I較CC基因型(1.521±0.028)ku/I明顯增高， NOS2-rs3794766基因型與血清總IgE濃度具有相關(guān)性(P=0.019，β=-0.131， 95%CI：-0.229～-0.021)，詳見表4。在AR患者中，各候選SNP位點(diǎn)基因型與血清總IgE濃度均未見相關(guān)性(P>0.05)，詳見表5。

表1 NOS2基因SNPs等位基因頻率在AR病例組和對照組間的比較Tab.1 Allele frequencies of SNPs in NOS2 between AR patients and control subjects n(%)

表2 NOS2基因SNPs基因型分布在AR病例組和對照組間的比較Tab.2 Genotype distribution of SNPs in NOS2 between AR patients and control subjects n(%)

圖1 NOS2基因SNPs位點(diǎn)及連鎖不平衡區(qū)塊結(jié)構(gòu)Fig.1 Graphical representation of SNPs locations and linkage disequilibrium(LD) structure in NOS2

Left: The measure of LD(D’) among all possible pairs of SNPs was shown graphically according to the shade of color， where white represented very low D’and scarlet represented very high D’. The numbers in squares were D’values(D’×100);Right: The measure of LD(r2) among all possible pairs of SNPs was shown graphically according to the shade of color， where white represented very low r2and black represented very high r2. The numbers in squares were r2values (r2×100).

表3 NOS2基因SNPs單倍型分析Tab.3 Haplotypic association of SNPs in NOS2 with AR n(%)

表4 健康對照NOS2基因SNPs與血清總IgE濃度的相關(guān)性分析Tab.4 Association between SNPs in NOS2 and total serum IgE level in control subjects

表5 AR患者NOS2基因SNPs與血清總IgE濃度的相關(guān)性分析Tab.5 Association between SNPs in NOS2 and total serum IgE level in AR patients

3 討論

AR是一種受遺傳和環(huán)境因素共同作用的疾病，兩種因素在AR的發(fā)生過程中均占有重要地位。關(guān)于AR的遺傳學(xué)研究，近年來有關(guān)基因多態(tài)性與AR發(fā)病之間的相關(guān)性研究越來越多，多種基因包括白介素及其受體編碼基因、趨化因子及其受體編碼基因、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化酶編碼基因、白三烯/脂氧合酶通路相關(guān)編碼基因的多態(tài)性均已證實(shí)與AR發(fā)病有關(guān)聯(lián)[7]，本實(shí)驗(yàn)室以往的研究[8]也證實(shí)T輔助(T helper， Th)2類細(xì)胞因子胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin， TSLP)基因的單核苷酸多態(tài)性與AR發(fā)病無相關(guān)性；人類皰疹病毒4型誘導(dǎo)基因3(Epstein-Barr virus-induced gene 3，EBI3)的rs428253位點(diǎn)的CG/CC基因型是AR發(fā)生的保護(hù)因素，rs3761548-rs4824747的AG基因型與AR發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[9]。

NO是生物體內(nèi)重要的信使分子和效應(yīng)分子，參與體內(nèi)眾多的病理生理過程。NOS是NO生成過程中的關(guān)鍵酶，根據(jù)NOS的組織和細(xì)胞來源分為3種類型：神經(jīng)元型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)，其中nNOS和eNOS主要負(fù)責(zé)基礎(chǔ)NO合成，被激活后僅引起NO少量短期的增加，參與信號傳遞，調(diào)節(jié)各種生理功能；而NOS2基因編碼的iNOS則多在炎性疾病時(shí)被細(xì)胞因子或免疫微生物刺激激活，激活后會合成大量NO，作用時(shí)間長達(dá)幾個(gè)小時(shí)，在機(jī)體防御機(jī)制中發(fā)揮一定作用，但是由于iNOS常一誘發(fā)就難以收拾，造成NO的過度制造，繼而會引發(fā)一系列病理過程[10]。研究[11]顯示，AR患者呼出氣體中NO濃度增高，其可能的原因是變應(yīng)原刺激鼻黏膜內(nèi)iNOS活性增加，因而NO釋放增加，參與繼發(fā)的炎性反應(yīng)。此外，AR患者鼻甲黏膜組織中iNOS陽性細(xì)胞較正常鼻甲黏膜組織明顯增加；AR患者鼻黏膜上皮、腺上皮及巨噬細(xì)胞增生，并且iNOS mRNA 表達(dá)高度增強(qiáng)。這些研究提示，iNOS/NO通路在AR的發(fā)病過程中可能發(fā)揮了重要作用。

NOS2基因位于17號染色體上，全長37kb，含26個(gè)外顯子，在外顯子2上有轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，外顯子26上有終止密碼。其啟動子區(qū)含有多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，也是細(xì)胞因子誘導(dǎo)的啟動子活性所必需的。NOS2基因啟動子有多個(gè)重疊的、開放的閱讀框架，啟動子的多態(tài)性很可能影響iNOS的表達(dá)[12]。盡管NOS2基因多態(tài)性在不同人群中被證實(shí)與多種疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13]、哮喘[14]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[15]具有相關(guān)性。AR和哮喘被認(rèn)為是“同一氣道，同一疾病”，兩者關(guān)系十分密切[16-17]。Bouzigon等[18]在法國哮喘人群中開展的一項(xiàng)3種NOS基因多態(tài)性與引發(fā)哮喘狀態(tài)呼出NO表型的相關(guān)性研究顯示，NOS2基因多態(tài)性與呼出氣一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide， FeNO)和血漿、呼出氣冷凝液(plasma and exhaled breath condensate， EBC)亞硝酸-硝酸鹽濃度相關(guān)。一項(xiàng)在日本人群的研究[14]報(bào)道了NOS2基因啟動子區(qū)的CCTT短串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性與未治療哮喘患者FeNO濃度相關(guān)。但是，關(guān)于NOS2基因多態(tài)性與AR發(fā)病的相關(guān)性尚無研究報(bào)道。本研究中筆者首次發(fā)現(xiàn)，在中國北方單純塵螨過敏AR人群中，NOS2基因多態(tài)性與AR發(fā)病有一定的相關(guān)性，NOS2-rs3794764的AA+AG基因型相對GG基因型是AR的危險(xiǎn)因素(OR=1.413，95%CI:1.005～1.987)；此外，在健康對照人群中，NOS2-rs3794766基因型與血清總IgE濃度具有相關(guān)性，其中，rs3794766位點(diǎn)的TT+CT基因型血清總IgE濃度較CC基因型明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究初步探討了NOS2基因多態(tài)性與HDM-sensitive AR的關(guān)系，筆者發(fā)現(xiàn)NOS2-rs3794764位點(diǎn)多態(tài)性可能與中國北方人群塵螨過敏有一定的相關(guān)性，此外，NOS2-rs3794766基因型與血清總IgE濃度具有一定的相關(guān)性，提示NOS2-rs3794766多態(tài)性與變應(yīng)性因素有一定的關(guān)聯(lián)。這個(gè)結(jié)果可為進(jìn)一步研究AR的發(fā)病機(jī)制、預(yù)防和預(yù)測AR發(fā)生提供理論依據(jù)，但由于本研究樣本數(shù)量有限，尚需擴(kuò)大樣本量來印證結(jié)果的可靠性。

[1] Zhang L， Han D, Huang D, et al. Prevalence of self-reported allergic rhinitis in eleven major cities in China[J]. Int Arch Allergy Immunol， 2009， 149(1): 47-57.

[2] 王明捷，張羅. NO在呼吸系統(tǒng)的生物學(xué)作用[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2012， 26(3): 138-141.

[3] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委會鼻科組， 中華醫(yī)學(xué)會耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)分會鼻科學(xué)組. 變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2015年，天津)[J]. 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2016， 51(1): 6-24.

[4] 張媛，趙延明，段甦，等. FCERlA基因單核苷酸多態(tài)性與變應(yīng)性鼻炎血清總IgE含量的相關(guān)性分析[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2012， 47(4): 289-293.

[5] International Hapmap consortium. A haplotype map of the human genome[J].Nature， 2005， 437(7063):1299-1320.

[6] Barrett J C， Fry B， Maller J，et al. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps[J]. Bioinformatics， 2005， 21(2): 263-265.

[7] 洪蘇玲. 淺談變應(yīng)性鼻炎的基因多態(tài)性[J]. 臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2015， 29(9): 781-783.

[8] Zhang Y， Song X， Zhao Y， et al. Single nucleotide polymorphisms in thymic stromal lymphopoietin gene are not associated with allergic rhinitis susceptibility in Chinese subjects[J]. BMC Med Genet， 2012， 13:79.

[9] Zhang Y， Duan S， Wei X， et al. Association between polymorphisms in FOXP3 and EBI3 genes and the risk for development of allergic rhinitis in Chinese subjects[J]. Hum Immunol， 2012， 73(9): 939-945.

[10] 矯健，張羅. 一氧化氮對呼吸道纖毛運(yùn)動的調(diào)控機(jī)制[J]. 國際耳鼻咽喉頭頸外科雜志， 2009， 33(4): 235-238.

[11] Kang B H， Chen S S， Jou L S， et al. Immunolocalization of inducible nitric oxide synthase and 3-nitrotyrosine in the nasal mucosa of patients with rhinitis[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol， 2000， 257(5):242-246.

[12] 侯海娟，張潔，黃萍. 一氧化氮合成酶基因多態(tài)性在全身性疾病及牙周炎中的研究進(jìn)展[J]. 國際口腔醫(yī)學(xué)雜志， 2011， 38(2):200-203.

[13] Negi V S， Mariaselvam C M， Misra D P， et al. Polymorphisms in the promoter region of iNOS predispose to rheumatoid arthritis in south Indian Tamils[J]. Int J Immunogenet， 2017， 44(3):114-121.

[14] Sato S， Wang X， Saito J， et al. Exhaled nitric oxide and inducible nitric oxide synthase gene polymorphism in Japanese asthmatics[J]. Allergol Int， 2016， 65(3):300-305.

[15] 董娟，郎平，吳昌凡. 一氧化氮和一氧化氮合酶基因多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變[J]. 國際眼科雜志， 2010， 10(11): 2144-2146.

[16] 王淑玉，鄭一博，呂朝霞.特異性免疫治療對兒童過敏性鼻炎-哮喘綜合征的效果觀察[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2016，28(10)：65-68.

[17] 馬思遠(yuǎn), 婁鴻飛,王成碩,等.北京地區(qū)可疑過敏性鼻炎病人吸入性變應(yīng)原特征分析[J].首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，38(5)：671-676.

[18] Bouzigon E， Monier F， Boussaha M， et al.Associations between nitric oxide synthase genes and exhaled NO-related phenotypes according to asthma status[J]. PLoS One， 2012， 7(5): e36672.