轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1對(duì)慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉上皮緊密連接屏障功能的影響

矯 健 張 羅，2*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 北京市耳鼻咽喉科研究所 教育部耳鼻咽喉頭頸科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鼻病研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院鼻過敏科，北京 100730)

慢性鼻-鼻竇炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps， CRSwNP)是以鼻竇鼻腔黏膜的慢性炎性反應(yīng)及息肉形成為主要特征的上呼吸道常見疾病，在全球人口中發(fā)病率為0.5%～4%，主要癥狀為鼻塞、黏性或黏膿性鼻涕、頭面部脹痛、嗅覺減退或喪失等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。鼻息肉發(fā)病與多種因素有關(guān)，如遺傳因素、免疫缺陷、纖毛功能障礙、阿司匹林耐受不良等，但發(fā)病機(jī)制至今尚不明確。

鼻黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接(tight junction， TJ)屏障是呼吸道屏障功能的重要組成成分，主要由多種跨膜蛋白如claudin家族、occludin、tricellulin和骨架蛋白如zonula occludens(ZO)-1、ZO-2、ZO-3、cingulin組成[2-3]。其主要功能為：調(diào)控上皮細(xì)胞間的密閉性和通透性，阻止外界致病原如細(xì)菌、病毒和過敏原等進(jìn)入機(jī)體；調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生和分化；參與機(jī)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和固有免疫等[4-5]。

鼻黏膜上皮屏障功能破壞與鼻息肉發(fā)病密切相關(guān)，Soyka等[6]在西方鼻息肉患者人群中研究發(fā)現(xiàn)，鼻上皮屏障功能受炎性因子γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)和白細(xì)胞介素-4(interleukin-4，IL-4)調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)室前期研究[7]也提示，在中國(guó)鼻息肉患者中，鼻黏膜中緊密連接蛋白ZO-1和claudin-1表達(dá)量降低，但是關(guān)于中國(guó)鼻息肉患者鼻上皮緊密連接功能的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1， TGF-β1)是一種具有顯著免疫調(diào)節(jié)和致纖維化功能的多效性細(xì)胞因子，在免疫抑制和組織重塑中發(fā)揮重要作用。此外，TGF-β1還可在多種細(xì)胞類型中調(diào)控上皮緊密連接屏障功能如人肺上皮細(xì)胞、人支氣管上皮細(xì)胞、人腸上皮細(xì)胞等[8-10]。盡管已知TGF-β1在鼻黏膜炎性反應(yīng)的組織重塑中發(fā)揮重要作用，但是關(guān)于其對(duì)鼻黏膜上皮屏障功能的調(diào)控作用目前尚未有報(bào)道，本研究旨在體外培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細(xì)胞(健康對(duì)照及鼻息肉來源的鼻上皮細(xì)胞)中探討TGF-β1對(duì)上皮緊密連接屏障功能的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究獲首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：TRECK 2014-12)，所有受試者均已簽署知情同意書。總計(jì)有10例健康對(duì)照(6例男性，4例女性，年齡20～60歲)和12例鼻息肉患者(7例男性，5例女性，年齡25～59歲)入組研究。鼻息肉組診斷符合歐洲鼻竇炎及鼻息肉診療指南2012年版(European Position Paper on Rhinosinusitis and Nasal Polyps， EPOS)及中國(guó)慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南(2012年，昆明)[1]，鼻內(nèi)鏡手術(shù)中留取患者鼻息肉組織。健康對(duì)照組來自接受鼻中隔校正術(shù)的單純鼻中隔偏曲患者，不伴有其他鼻部炎性反應(yīng)，手術(shù)中留取患者的中鼻甲黏膜。術(shù)前4周內(nèi)局部或全身應(yīng)用糖皮質(zhì)激素患者除外，真菌性鼻竇炎、后鼻孔息肉、傳染性疾病以及腫瘤患者除外。

引物序列為：EF1α正向引物5′-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3′, 反向引物 5′-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3′; claudin-1正向引物 5′-CAGTCAATGCCAGGTACGAATTT-3′, 反向引物 5′-AAGTAGGGCACCTCCCAGAAG-3′; claudin-4正向引物 5′-TGTACCAACTGCCTGGAGGAT-3′, 反向引物 5′-GACACCGGCACTATCACCATAA-3′; occludin正向引物5′-GATGAGCAGCCCCCCAAT-3′, 反向引物 5′-GGTGAAGGCACGTCCTGTGT-3′; ZO-1正向引物 5′-ACAGTGCCTAAAGCTATTCCTGTGA-3′, 反向引物 5′-TCGGGAATGGCTCCTTGAG-3′; ZO-2正向引物5′-CGGTTAAATACCGTGAGGCAAA-3′, 反向引物 5′-GGGAACCACTGGGTGTAATTCA-3′。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、刺激與跨膜阻力(transepithelial resistance， TER)檢測(cè)

TGF-β1刺激上皮細(xì)胞72 h后，甲醇-丙酮(50∶50)混合液固定上皮細(xì)胞，0.3%(體積分?jǐn)?shù)) triton X-100 通透，5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉封閉。部分細(xì)胞用Alexa488標(biāo)記anti-occludin 抗體 (1∶100， 美國(guó)Invitrogen公司)直接染色，部分細(xì)胞用anti-ZO-1抗體(1∶200， 美國(guó)Invitrogen公司)孵育過夜后，加入Alexa488標(biāo)記的二抗。DAPI復(fù)染后封片，激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯IX 81顯微鏡，日本)下觀察。

1.3 細(xì)胞間熒光素通透性檢測(cè)

1.4 免疫熒光染色

健康對(duì)照鼻黏膜及鼻息肉黏膜組織經(jīng)蛋白酶消化過夜后，接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，于人支氣管上皮培養(yǎng)基(bronchial epithelial growth medium， BEGM)(美國(guó)Lonza公司)中常規(guī)培養(yǎng)，待上皮細(xì)胞擴(kuò)增至80%～90%時(shí)行胰蛋白酶消化，按照1.5×105細(xì)胞/孔密度接種于人胎盤膠原預(yù)鋪板的transwell雙層培養(yǎng)皿(美國(guó)Corning公司)中開始?xì)庖航缑?air-liquid interface， ALI)培養(yǎng)，待上層膜中細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，去除上層培養(yǎng)液，僅從基底側(cè)給予DMEM∶BEGM(1∶1)培養(yǎng)基，同時(shí)培養(yǎng)基中添加5×10-8mol/L視黃酸，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞分化完全、TER達(dá)到平臺(tái)期后(氣液培養(yǎng)21 d左右)開始加藥刺激。TGF-β1(1 ng/mL、10 ng/mL)(美國(guó)R & D公司)分別從基底側(cè)給予細(xì)胞，對(duì)照組不作處理，在刺激前(0 h)、刺激后24、48、72 h分別應(yīng)用TER檢測(cè)儀(Millicell-ERS， 美國(guó)Millipore公司)測(cè)量上皮細(xì)胞跨膜阻力。

1.5 mRNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

TGF-β1刺激上皮細(xì)胞72 h后，直接用RLT緩沖液裂解細(xì)胞，用RNeasy mini試劑盒(英國(guó)Qiagen公司)提取總RNA，提取步驟參照說明書進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度(A260/A280在1.8～2.0之間)，1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性。應(yīng)用QuantScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20 ℃保存。

根據(jù)UltraSYBR Mixture(With ROX)試劑盒說明，檢測(cè)各基因mRNA表達(dá)情況。擴(kuò)增程序：95 ℃ 10min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)×45個(gè)循環(huán)。以延長(zhǎng)因子(elongation factor 1α，EF1α)為內(nèi)參對(duì)照，以熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Cycle threshold, Ct)計(jì)算相對(duì)表達(dá)量：相對(duì)表達(dá)量=2-△Ct，每例樣品重復(fù)3次，取平均值。

健康對(duì)照來源的鼻上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白o(hù)ccludin和ZO-1表達(dá)呈現(xiàn)連續(xù)的線性結(jié)構(gòu)，而鼻息肉來源的上皮細(xì)胞間兩種緊密連接蛋白表達(dá)模式受到明顯破壞，緊密連接線性結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)分離、斷裂等，而經(jīng)10 ng/mL TGF-β1刺激后，無論是健康對(duì)照還是鼻息肉來源的上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)模式均較加藥前有明顯破壞(圖2A、B)。

重慶市婚管中心于2016年9月28日正式啟動(dòng)重慶市婚姻家庭社會(huì)工作“家和計(jì)劃”特色服務(wù)項(xiàng)目。該項(xiàng)目形成了以重慶市民政局為領(lǐng)導(dǎo)，以重慶市婚姻收養(yǎng)登記管理中心為統(tǒng)籌，以重慶市質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化研究院為標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)向，以各區(qū)縣婚姻登記處為依托，以“社區(qū)+社工”為載體的服務(wù)團(tuán)隊(duì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

TGF-β1刺激上皮細(xì)胞72 h后，加入熒光素FITC-葡聚糖(FITC-Dextran) (2 mg/mL)于transwell培養(yǎng)皿上層內(nèi)，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h，取下層培養(yǎng)液，酶標(biāo)儀(ELISA reader Mithras LB940; Berthold Technologies；德國(guó))檢測(cè)FITC-Dextran的熒光強(qiáng)度(480 nm)。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1刺激對(duì)鼻上皮細(xì)胞TER和細(xì)胞間熒光素通透性的影響

在氣液界面培養(yǎng)21d，鼻息肉來源的上皮細(xì)胞TER明顯低于健康對(duì)照上皮細(xì)胞，而細(xì)胞間熒光素FITC-Dextran的通透性則明顯高于對(duì)照組上皮細(xì)胞(圖 1A)。10 ng/mL TGF-β1刺激上皮細(xì)胞72 h，無論是在健康對(duì)照還是鼻息肉來源的上皮細(xì)胞中，均可明顯降低上皮細(xì)胞TER，同時(shí)增加細(xì)胞間FITC-Dextran通透性，而1 ng/mL TGF-β1刺激72 h，對(duì)兩種來源的鼻上皮細(xì)胞TER和細(xì)胞間FITC-Dextran通透性均無明顯影響(圖1B、C)。

2.2 TGF-β1刺激對(duì)鼻上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

“念到您現(xiàn)在所肩的責(zé)任的重大，我便連孺慕之思都不敢道及，希望您能原諒我，只要您知道我是真心敬慕您，我便夠快活的了。”

“小劉和報(bào)社簽訂有勞動(dòng)合同，她在所供職報(bào)社報(bào)紙上發(fā)的稿件，取得的收入，與其他收入一起，合并為工資薪金所得，并非新個(gè)稅法中所稱的稿酬所得。她投稿給其他媒體、電臺(tái)的時(shí)評(píng)收入，屬于稿酬所得?！睗?jì)南市稅務(wù)局個(gè)人所得稅處負(fù)責(zé)人答復(fù)，修改后的新個(gè)稅法允許勞務(wù)報(bào)酬、稿酬、特許權(quán)使用費(fèi)等三類收入在扣除20%的費(fèi)用后計(jì)算納稅。也就是說，按原收入額打八折計(jì)算納稅。

在靜息未刺激狀態(tài)下，鼻息肉來源的上皮細(xì)胞中claudin-1 mRNA表達(dá)較健康對(duì)照上皮細(xì)胞有增加趨勢(shì)(圖 3A)，而10 ng/mL TGF-β1刺激后，無論是健康對(duì)照還是鼻息肉來源的上皮細(xì)胞中，TJ mRNA表達(dá)水平較未刺激狀態(tài)下有增高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 3B、C)。

在公共英語課教師潛移默化地讓學(xué)生接觸專業(yè)英語的同時(shí)，學(xué)校可以在低年級(jí)開設(shè)專業(yè)英語方面的選修課，讓學(xué)生盡早接觸專業(yè)英語，待開設(shè)專業(yè)英語課時(shí)，學(xué)生對(duì)此已不陌生，也不會(huì)將課程視為負(fù)擔(dān)，從而消除畏難情緒，降低教學(xué)難度。在教學(xué)形式上，教師應(yīng)考慮到課程既要教授專業(yè)英語知識(shí)，又要重視英語知識(shí)的專業(yè)性，要讓學(xué)生在專業(yè)英語課上也能鞏固平時(shí)所學(xué)專業(yè)知識(shí)，使專業(yè)課成績(jī)不好的學(xué)生也能在課上獲益，消除兩頭都學(xué)不好的顧慮。

2.3 TGF-β1刺激對(duì)鼻上皮細(xì)胞緊密連接基因表達(dá)的影響

The dissipation due to charging and discharging capacitances Edyn can be calculated as

3 討論

鼻黏膜上皮細(xì)胞形成的緊密連接屏障是呼吸道重要的防御機(jī)制之一，既有效阻止了病原體及有害顆粒對(duì)上皮下組織的侵害，又可通過調(diào)節(jié)其對(duì)炎性反應(yīng)細(xì)胞的透過性而參與炎性反應(yīng)。鼻黏膜上皮屏障的破壞導(dǎo)致大量病原體、毒素及過敏原進(jìn)入黏膜下組織，與多種疾病的發(fā)病相關(guān)，如特應(yīng)性皮炎、支氣管哮喘、炎性腸病等[11-12]。本研究在體外細(xì)胞培養(yǎng)模型中評(píng)估了中國(guó)漢族人群鼻息肉患者上皮緊密連接屏障功能的改變，發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照上皮細(xì)胞相比，鼻息肉患者上皮細(xì)胞TER明顯降低，同時(shí)上皮細(xì)胞間對(duì)熒光素FITC-Dextran的通透性明顯增加，說明鼻息肉患者上皮屏障功能有明顯破壞，是CRSwNP發(fā)病相關(guān)因素之一。

圖1 TGF-β1對(duì)人鼻上皮細(xì)胞跨膜阻力和細(xì)胞間FITC-Dextran通透性的影響。Fig.1 Effect of TGF-β1 on human nasal epithelial transepithelial resistance(TER) and paracellular FITC-dextran flux

A： Comparison of baseline TER and paracellular FITC-Dextran flux in epithelial cells from healthy control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) under resting conditions without any stimulation.*P<0.05vscontrol groups；B： Effects of TGF-β1 stimulation on TER in epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12).#P<0.05vsu.s. group；C： Effects of TGF-β1 stimulation on paracellular FITC-Dextran flux in epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP (n=12).#P<0.05vsu.s. group.TER：transepithelial resistance;u.s.:unstimulated;TGF-β1:transforming growth factor-β1;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

圖2 TGF-β1對(duì)人鼻上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of TGF-β1 on human nasal epithelial tight junction(TJ) protein expression

Representative immunofluorescence staining for occludin(A) and ZO-1(B) in epithelial cells from healthy control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) in u.s. conditions and after 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h.Arrowspoint out stratification of TJs. Bar=20 μm;u.s.:unstimulated;TGF-β1:transforming growth factor-β1;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

圖3 TGF-β1對(duì)人鼻上皮細(xì)胞緊密連接基因mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effects of TGF-β1 on human nasal epithelial tight junction(TJ) mRNA expression

A： comparison of TJ mRNA expression in human nasal epithelial cells from control subjects(n=10) and patients with CRSwNP(n=12) in resting conditions without any stimulation；B： effects of 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h on TJ mRNA expression in epithelial cells from control subjects(n=10)；C： effects of 10 ng/mL TGF-β1 stimulation for 72 h on TJ mRNA expression in epithelial cells from patients with CRSwNP(n=12).TGF-β1:transforming growth factor-β1;u.s.:unstimulated;CRSwNP:chronic rhinosinusitis with nasal polyps.

墾利油田群中某待開發(fā)油田A所產(chǎn)原油黏度較高，50℃下黏度為2700 mPa·s，擬采用依托周邊油田開發(fā)。選取周邊可能被依托開發(fā)的3個(gè)不同黏度梯隊(duì)的稀油油田原油(稱為稀油a、稀油b和稀油c)作為組分油。按照各油田產(chǎn)油量配比，分別與墾利油田A原油摻混，利用HAAKE MARS高溫高壓流變儀及配套溫控器對(duì)混合原油進(jìn)行測(cè)量，各組分油黏溫特性如圖1～圖2所示。

鼻息肉患者具有不同的炎性表型，西方人群的鼻息肉患者多表現(xiàn)為Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，伴有IL-5等炎性因子升高；而亞洲人群鼻息肉患者則表現(xiàn)為混合性T細(xì)胞免疫反應(yīng)和非嗜酸性炎性反應(yīng)[13-15]。有文獻(xiàn)[6]提示不同人種的鼻息肉患者中上皮緊密連接屏障的調(diào)控機(jī)制也有所不同，比如在高加索人群中，炎性因子IFN-γ和IL-4調(diào)控鼻息肉的屏障功能，而在澳大利亞鼻息肉患者中，Th17細(xì)胞因子在鼻黏膜屏障破壞中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[16]。因此，本研究探討了中國(guó)漢族人群鼻息肉患者上皮屏障的調(diào)控機(jī)制，首次發(fā)現(xiàn)TGF-β1對(duì)人鼻上皮細(xì)胞緊密連接有重要的調(diào)控作用，其在健康對(duì)照及鼻息肉來源的上皮細(xì)胞上均可顯著破壞上皮緊密連接，導(dǎo)致細(xì)胞TER降低，細(xì)胞間熒光素通透增加，破壞緊密連接蛋白表達(dá)模式，說明TGF-β1在CRSwNP屏障功能破壞中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，或可作為治療干預(yù)的靶位點(diǎn)。

本研究結(jié)果中，在靜息狀態(tài)下鼻息肉來源的鼻上皮細(xì)胞TJ基因mRNA表達(dá)水平與健康對(duì)照上皮細(xì)胞相比，僅claudin-1 mRNA表達(dá)有升高趨勢(shì)；而在10 ng/mL TGF-β1刺激后，TJ基因mRNA表達(dá)較未刺激前也無明顯的變化，這與靜息狀態(tài)下息肉來源的上皮細(xì)胞TER明顯低于健康對(duì)照上皮，F(xiàn)ITC-Dextran通透性高于對(duì)照上皮；而10 ng/mL TGF-β1刺激后，兩種來源的上皮細(xì)胞TER明顯降低，F(xiàn)ITC-Dextran通透性增加，TJ表達(dá)蛋白模式明顯破壞結(jié)果不符。TJ相關(guān)基因在mRNA和蛋白水平表達(dá)不一致的原因尚不清楚，筆者推測(cè)是一個(gè)逆調(diào)節(jié)效應(yīng)后果，但該結(jié)果也提示了CRSwNP上皮緊密連接屏障功能的非mRNA水平調(diào)控機(jī)制，具體的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。

綜上所述，本研究證實(shí)在中國(guó)漢族人群的鼻息肉患者中，鼻上皮細(xì)胞緊密連接屏障功能有明顯破壞，是鼻息肉發(fā)病相關(guān)因素之一；而細(xì)胞因子TGF-β1在鼻息肉上皮緊密連接功能破壞中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，提示TGF-β1或可作為鼻息肉干預(yù)治療的靶位點(diǎn)。

[1] 中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會(huì)鼻科組. 中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)分會(huì)鼻科學(xué)組. 慢性鼻-鼻竇炎診斷和治療指南(2012年，昆明)[J].中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2013，48(2): 92-94.

[2] Chiba H， Osanai M， Mu