棗縮果病初侵染互隔鏈格孢菌抗藥性研究

張 敏 ，王 迎 ，史曉夢(mèng) ，田紅雨 ，甄志先 ，冉隆賢

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.林學(xué)院；b.河北省林木種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

棗縮果病是棗生產(chǎn)中最嚴(yán)重的果實(shí)病害，現(xiàn)已遍及全國(guó)各大棗區(qū)。受害的棗果由外向內(nèi)逐漸出現(xiàn)褐色壞死現(xiàn)象，病組織呈海綿狀[1]，于成熟前脫落[2]，無(wú)商品價(jià)值。據(jù)報(bào)道，互隔鏈格孢菌是引起棗縮果病的初侵染病原菌[3]，該病害在河北、河南、山東和山西各大棗區(qū)均有大面積爆發(fā)的報(bào)道[4]，嚴(yán)重影響了棗的品質(zhì)和產(chǎn)量。

棗縮果病以化學(xué)防治為主[5]。許陽(yáng)等的試驗(yàn)結(jié)果表明，異菌脲有明顯的防治效果[6]；邢藝林等研究認(rèn)為，異菌脲和苯甲丙環(huán)唑均有明顯的防治效果[7]。但是，已有關(guān)于生產(chǎn)中存在鏈格孢屬真菌對(duì)異菌脲產(chǎn)生抗藥性問(wèn)題的研究報(bào)道。Mcphee研究發(fā)現(xiàn)了抗異菌脲的互隔鏈格孢菌突變體[8]；黃思良從自然界中分離得到了抗異菌脲的互隔鏈格孢菌突變體菌株[9]；Simoneau等報(bào)道，甘藍(lán)鏈格孢菌對(duì)二甲酰亞胺類殺菌劑有很強(qiáng)的抗性[10]；Ma從開心果中分離到了抗異菌脲的鏈格孢屬真菌[11]；其它植物病原菌對(duì)異菌脲的抗藥性也相繼被發(fā)現(xiàn)[12-17]。另外，互隔鏈格孢菌對(duì)甲基硫菌靈和腐霉利產(chǎn)生抗性也有報(bào)道[18-19]。

由此可見，長(zhǎng)期單一噴施異菌脲易使鏈格孢屬真菌產(chǎn)生抗藥性，而棗縮果病初侵染互隔鏈格孢菌是否對(duì)異菌脲產(chǎn)生抗性尚未見諸報(bào)道。為此，本研究選取分離自未使用過(guò)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑棗園的4株棗縮果病菌A. alternata[3]，分別測(cè)定了其對(duì)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的敏感性，從中篩選抗性菌株，并檢測(cè)其交互抗性。通過(guò)交互抗性的分析和林間防治效果的試驗(yàn)，確定林間最適施藥方案，以期為棗縮果病菌抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試菌株：互隔鏈格孢菌4個(gè)菌株CN191、CN192、CN193和CN194，分別于2011年分離自河南新鄭和濮陽(yáng)、河北行唐和唐縣的病果。

供試藥劑：50%異菌脲可濕性粉劑，由美國(guó)富美實(shí)公司生產(chǎn)；50%苯甲丙環(huán)唑，由青島泰升生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 棗縮果病菌對(duì)2種殺菌劑的敏感性的測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定棗縮果病菌對(duì)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的敏感性。將互隔鏈格孢菌各菌株置于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）上，25 ℃黑暗培養(yǎng)7 d以備用。在超凈工作臺(tái)上，用 0.7 cm 打孔器沿預(yù)培養(yǎng)7d的棗縮果病菌菌落邊緣打取菌碟，然后，將菌碟接種到分別含有0.002、0.010、0.020、0.100、0.200 mg·mL-1的 異 菌 脲 和 0.01、0.02、0.10、0.20、1.00 mg·mL-1的苯甲丙環(huán)唑的PDA培養(yǎng)基中央，每個(gè)處理重復(fù)3次。將接種后的培養(yǎng)皿放入25 ℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。當(dāng)對(duì)照組菌落直徑達(dá)到30 mm時(shí)，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，計(jì)算藥劑不同濃度處理對(duì)各互隔鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率[20]。求出毒力回歸方程y＝a＋bx，根據(jù)方程計(jì)算2種殺菌劑抑制各菌株菌絲生長(zhǎng)的有效抑制濃度 EC50值（mg·mL-1）及相關(guān)系數(shù) r。根據(jù)EC50值分析采自同一年份、不同地區(qū)的棗縮果病菌對(duì)這2種殺菌劑的敏感性。

菌絲生長(zhǎng)抑制率(%)＝(對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑)/(處理菌落直徑－0.7)×100%。

1.2.2 突變體菌株的篩選

在無(wú)菌環(huán)境下，用無(wú)菌水分別配制 100 mg·mL-1異菌脲和苯甲丙環(huán)唑母液以備用。制作含有不同濃度梯度的異菌脲和苯甲丙環(huán)唑藥劑的PDA培養(yǎng)基，其起始濃度設(shè)定為0.005 mg·mL-1，并依次將藥劑濃度提高到0.01、0.02、0.05、0.10、0.15和0.20 mg·mL-1。取濃度為 400 ～ 500 個(gè)·mL-1的孢子懸浮液100 μL，分別均勻涂布于含有異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的培養(yǎng)基上，于25 ℃條件下培養(yǎng)。以涂布無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。待含有0.005 mg·mL-1藥劑的PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出突變體單菌落后，再將突變體菌株轉(zhuǎn)接入PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待其長(zhǎng)出孢子后，配制濃度為400～500個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，取100 μL接入含有相應(yīng)高濃度的藥劑培養(yǎng)基中，依次重復(fù)，以培養(yǎng)菌株對(duì)異菌脲的抗性，最終得到抗異菌脲的突變體菌株CN194y。

1.2.3 突變體菌株的穩(wěn)定性檢測(cè)

將突變體菌株CN194y在不含異菌脲的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5代后，用打孔器取直徑為0.7 cm的菌落塊，并以野生型菌株CN194為對(duì)照，將其分別接種到含有0.20 mg·mL-1異菌脲和不含異菌脲的PDA培養(yǎng)基中央，置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d后，測(cè)量菌落生長(zhǎng)的直徑。

1.2.4 突變體菌株的致病性檢測(cè)

在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃，選擇無(wú)棗縮果病的試驗(yàn)地作為接種地。將通過(guò)穩(wěn)定性測(cè)試的突變體菌株CN194y的菌碟，刺傷接種在活體的棗果上。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)對(duì)照組，其中，第1對(duì)照組刺傷接種無(wú)菌的PDA培養(yǎng)基，第2對(duì)照組刺傷接種野生菌株CN194菌碟。發(fā)病后將病果帶回實(shí)驗(yàn)室分離，并置于含有0.20 mg·mL-1異菌脲的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察病原菌的生長(zhǎng)狀況，判定是否為接入的突變體菌株CN194y。

1.2.5 突變體菌株對(duì)2種藥劑的交互抗性的測(cè)定

選取8個(gè)抗異菌脲的突變體菌株CN194y，檢測(cè)苯甲丙環(huán)唑?qū)λ鼈兊亩玖Γ盟巹?duì)菌株的EC50值表示毒力。分析異菌脲和苯甲丙環(huán)唑之間的交互作用。

1.2.6 林間防治試驗(yàn)

將河北省行唐縣寺上村施用過(guò)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的試驗(yàn)地分成9個(gè)小區(qū)，處理和對(duì)照各3個(gè)小區(qū)，隨機(jī)分布；2016年7月1日開始，在試驗(yàn)地各小區(qū)內(nèi)分別噴施異菌脲1 000倍液和苯甲丙環(huán)唑3 000倍液。選取未施用過(guò)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的試驗(yàn)地，將其分成12個(gè)小區(qū)，處理和對(duì)照各3個(gè)小區(qū)，隨機(jī)分布；2017年6月28日開始，在各小區(qū)內(nèi)分別噴施異菌脲1 000倍液、苯甲丙環(huán)唑3 000倍液和兩種殺菌劑交替施用。上述各試驗(yàn)均每隔7 d噴藥1次，共噴施8次，對(duì)照噴施等量的清水。發(fā)病率的調(diào)查時(shí)間分別為發(fā)病初期和高峰期。各小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取發(fā)病一致的3株棗樹，每個(gè)處理9株棗樹，每株棗樹選擇4個(gè)枝條進(jìn)行調(diào)查，分別記錄噴藥棗樹的枝條及對(duì)照枝條的總果數(shù)和病果數(shù)，計(jì)算發(fā)病率和防治效果。

發(fā)病率(%)＝(病果總數(shù)/調(diào)查總果數(shù))×100%；

防治效果(%)＝(對(duì)照病果率－處理病果率)/對(duì)照病果率×100%。

1.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)記錄結(jié)果對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦轉(zhuǎn)換后，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)分析各處理平均值間的差異性，并用LSD 最小顯著差異法比較不同處理間的差異顯著性（α＝0.05或α＝0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗縮果病菌對(duì)2種殺菌劑敏感性

異菌脲和苯甲丙環(huán)唑2種藥劑的毒力回歸方程和有效中濃度分別見表1和表2。由表1和表2可知，CN191、CN192、CN193和CN194這4個(gè)菌株對(duì)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的敏感趨勢(shì)相同，其中，CN194對(duì)這2種藥劑的敏感性最強(qiáng)，CN192對(duì)這2種藥劑的敏感性最差。異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的處理濃度與抑制效果間均呈正相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別在0.91和0.94以上。

表1 異菌脲的毒力回歸方程和有效中濃度Table1 Virulence regression equations and median effective concentrations of iprodione

表2 苯甲丙環(huán)唑的毒力回歸方程和有效中濃度Table2 Virulence regression equations and median effective concentrations of benzoyl propiconazole

2.2 突變體菌株的篩選及穩(wěn)定性

用異菌脲和苯甲丙環(huán)唑分別處理CN194，篩選獲得能抗0.20 mg·mL-1異菌脲的突變體CN194y。將CN194y接種到無(wú)異菌脲的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)5代后，重新接回到含有異菌脲的培養(yǎng)基上，得到穩(wěn)定的抗異菌脲突變體菌株CN194y。在無(wú)異菌脲的PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5 d后，野生型菌株CN194和突變體菌株CN194y的菌落塊直徑分別為（5.30±0.07）和（5.30±0.06）cm，二者間無(wú)差異。在含有0.20 mg·mL-1異菌脲的PDA培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)5 d后，CN194y菌落塊直徑為（5.00±0.12）cm，其與在無(wú)異菌脲培養(yǎng)基上培養(yǎng)的CN194y的菌落塊直徑間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05）；野生型菌株CN194在含有0.20 mg·mL-1異菌脲的PDA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。此結(jié)果表明，抗異菌脲突變體菌株CN194y的突變特征明顯且穩(wěn)定。

2.3 突變體菌株的致病性

CN194y林間接種后可導(dǎo)致棗果發(fā)?。▓D1A），接種部位出現(xiàn)紅褐色凹陷的病斑，果肉病組織呈土黃色海綿狀壞死，于成熟前脫落，且與CN194自然狀態(tài)下致病癥狀相同（圖1B），說(shuō)明CN194y的致病性沒(méi)有變化。

2.4 突變體菌株對(duì)2種藥劑的交互抗性

圖1 抗異菌脲突變體菌株CN194y與野生型菌株CN194林間刺傷接種棗果的發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of jujube fruits inoculated through stab-wound with iprodione-resistant mutant strain CN194y and wild type strain CN194

將抗異菌脲突變體菌株CN194y分別接種在含有不同濃度苯甲丙環(huán)唑的培養(yǎng)基上，根據(jù)菌落直徑測(cè)得的毒力回歸方程為y＝1.308 4x＋8.865 4，EC50值為0.0011mg·mL-1，其相關(guān)系數(shù)為0.983 4，與野生型菌株 CN194的 EC50值（0.0013mg·mL-1）間的差異性不顯著（P＞0.05）。此結(jié)果表明，異菌脲和苯甲丙環(huán)唑之間無(wú)交互抗性。

2.5 林間噴施2種藥劑的防治效果

河北省行唐縣寺上村施用過(guò)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑棗園林間防治效果的調(diào)查結(jié)果見圖2。2016年9月2日在發(fā)病初期進(jìn)行第1次調(diào)查，異菌脲與苯甲丙環(huán)唑的防治效果分別為44.4%和83.3%；同年9月24日發(fā)病高峰期進(jìn)行第2次調(diào)查，異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的防治效果分別為30.8%和51.3%。兩次調(diào)查結(jié)果中，施用苯甲丙環(huán)唑與對(duì)照間均有顯著性差異（P＜0.05），而異菌脲的防治效果與對(duì)照間無(wú)顯著差異（P＞0.05），在施用過(guò)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的棗園內(nèi)，苯甲丙環(huán)唑的防治效果無(wú)論在發(fā)病初期還是后期都好于異菌脲。

圖2 2016年棗縮果病藥劑的防治效果Fig.2 Control effects of fungicides on jujube shrunken-fruit disease in 2016

河北省行唐縣寺上村未施用過(guò)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑棗園林間防治效果的調(diào)查結(jié)果見圖3。2017年8月29日在發(fā)病初期進(jìn)行第1次調(diào)查，結(jié)果表明，異菌脲、苯甲丙環(huán)唑和這2種藥劑交替施用的防治效果分別為92.9%、57.1%和61.9%，這3種施用方法的防治效果與對(duì)照間均有顯著性差異（P＜0.05），其中，異菌脲、苯甲丙環(huán)唑和這2種藥劑交替施用的防治效果間有顯著性差異（P＜0.05）。同年9月18日在發(fā)病高峰期進(jìn)行第2次調(diào)查，結(jié)果表明，異菌脲、苯甲丙環(huán)唑和這2種藥劑交替施用的防治效果分別為68.4%、47.4%和52.6%，這3種施用方法的防治效果與對(duì)照間均有顯著性差異（P＜0.05），但3種施用方法的防治效果間的差異性不顯著（P＞0.05）。綜合來(lái)看，在未施用過(guò)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的棗園內(nèi)，異菌脲無(wú)論在發(fā)病初期還是后期都顯示有較好的防治效果，且在發(fā)病初期的防治效果尤為突出。綜合兩種試驗(yàn)結(jié)果，2種藥劑交替施用將有助于避免病菌抗藥性的產(chǎn)生。

圖 3 2017年棗縮果病藥劑防治效果Fig.3 Control effects of fungicides on jujube shrunkenfruit disease in 2017

3 結(jié)論與討論

不同地區(qū)棗縮果病初侵染互隔鏈格孢菌對(duì)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的敏感性有差異，但敏感趨勢(shì)相同；互隔鏈格孢菌對(duì)異菌脲易產(chǎn)生抗藥性，而對(duì)苯甲丙環(huán)唑不易產(chǎn)生抗藥性，且2種藥劑之間不產(chǎn)生交互抗性。雖然林間施藥時(shí)異菌脲的防治效果好于苯甲丙環(huán)唑，但綜合室內(nèi)和林間試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，長(zhǎng)時(shí)間單一施用異菌脲會(huì)使互隔鏈格孢菌產(chǎn)生抗藥性，且抗性會(huì)逐年提升，影響防治效果；而苯甲丙環(huán)唑的林間防治效果穩(wěn)定，且室內(nèi)未篩選出抗苯甲丙環(huán)唑的互隔鏈格孢菌突變體。因此，林間防治棗縮果病應(yīng)做好相關(guān)監(jiān)測(cè)工作，將異菌脲和苯甲丙環(huán)唑交替施用，以延緩病菌抗藥性的產(chǎn)生。

調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，在連續(xù)施用過(guò)異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的棗園內(nèi)，異菌脲的防治效果較苯甲丙環(huán)唑差；在未施用過(guò)這2種藥劑的棗園內(nèi)，異菌脲的防治效果較苯甲丙環(huán)唑好，這與王海強(qiáng)[20]和陳帥民[12]的研究結(jié)果一致。異菌脲和苯甲丙環(huán)唑的防治效果稍遜于邢藝林的防治試驗(yàn)效果[7]，可能是由施藥時(shí)間推遲了15 d所致。趙樂(lè)研究認(rèn)為，棗縮果病菌可在花期侵入[21]；王森的研究結(jié)果表明，棗樹花期較長(zhǎng)，各品種花期約1～2個(gè)月[22]，因此，在初花期施藥效果最佳。據(jù)李新鳳研究報(bào)道，向日葵菌核病菌抗腐霉利的突變體菌株僅對(duì)同屬二甲酞亞胺類殺菌劑的異菌脲有正交互抗性，而對(duì)百菌清、多菌靈和福美雙等均無(wú)交互抗性[16]。本研究結(jié)果表明，交替施用2種不同類型的藥劑，也不產(chǎn)生交互抗性，這與上述報(bào)道的研究結(jié)果一致。

異菌脲為二甲酰亞胺類殺菌劑，Orth等認(rèn)為，此類殺菌劑可誘導(dǎo)菌體產(chǎn)生還原態(tài)的氧自由基，從而引起改變細(xì)胞膜通透性等一系列破壞細(xì)胞的連鎖反應(yīng)[23]。苯甲丙環(huán)唑有效成分為丙環(huán)唑與苯醚甲環(huán)唑，是甾醇脫甲基化抑制劑 ，能夠通過(guò)抑制細(xì)胞壁甾醇的生物合成來(lái)阻止真菌的生長(zhǎng)[24]，但王海強(qiáng)等人的研究結(jié)果表明，二甲酰亞胺類殺菌劑的內(nèi)吸性較差，抗性風(fēng)險(xiǎn)較高，應(yīng)作為保護(hù)性藥劑使用，且盡量與其它類型的藥劑輪換使用[20]。在生產(chǎn)實(shí)踐中，在使用異菌脲防治由鏈格孢菌引致的病害時(shí)，已發(fā)現(xiàn)了多個(gè)對(duì)異菌脲產(chǎn)生抗性的菌株[8-11,13,25-26]；在其它病原菌對(duì)殺菌劑的抗性及各殺菌劑間交互抗性的研究報(bào)道中，已見有多種殺菌劑易產(chǎn)生抗性的報(bào)道，且部分殺菌劑與其它殺菌劑間有正交互抗性[27-29]。本研究未發(fā)現(xiàn)鏈格孢菌對(duì)苯甲丙環(huán)唑產(chǎn)生抗性。但是，由于殺菌劑的種類較多，每年在棗縮果病發(fā)生時(shí)，農(nóng)戶盲目用藥，有病亂投醫(yī)現(xiàn)象突出，因此，有必要繼續(xù)探索與異菌脲作用機(jī)理不同的殺菌劑，并進(jìn)行輪換施用，同時(shí)，應(yīng)對(duì)防治棗縮果病的其它殺菌劑進(jìn)行抗性監(jiān)測(cè)及交互抗性研究，從而為持續(xù)控制棗縮果病提供技術(shù)支持。

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