強(qiáng)直性脊柱炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NKT細(xì)胞的表達(dá)及意義

徐文莉，羅 藝，李 康，廖長(zhǎng)征，林燕華，張洪德

(廣東省深圳市龍崗中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 518116)

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種主要侵犯中軸關(guān)節(jié)的全身性、慢性、進(jìn)行性炎性疾病。以骶髂關(guān)節(jié)為首發(fā)病變部位，病變可累及骶髂關(guān)節(jié)、脊柱和外周關(guān)節(jié)，以及眼、心、肺等多器官。起病大多緩慢而隱匿，男性青壯年多見(jiàn)，病情嚴(yán)重可致畸、致殘最后導(dǎo)致患者生活不能自理，而且較女性嚴(yán)重。AS在全球的患病率為0.1%～1.4%[1]。AS的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明[2]，大多認(rèn)為與遺傳、感染、免疫因素等有關(guān)[3-5]，但目前淋巴細(xì)胞免疫功能異常在AS中的研究備受關(guān)注[6-9]。研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞亞群在AS發(fā)病過(guò)程起著重要的作用。自然殺傷性T細(xì)胞(NKT) 是一群既有T細(xì)胞受體又有NK細(xì)胞受體的淋巴細(xì)胞亞群，以CD3+CD16+CD56+作為NKT細(xì)胞的表面標(biāo)志物，其生物學(xué)作用主要包括免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞毒作用，被激活后可分泌大量的細(xì)胞因子包括γ-干擾素(γ-IFN)、白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-10、IL-13等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AS 患者以及健康人外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NKT細(xì)胞水平，探討T淋巴細(xì)胞亞群及NKT與AS間的關(guān)系，為AS的研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年7月至2016年7月在本院就診的AS患者69例作為病例組，其中男35例，女34例，年齡19～53歲。AS診斷符合1984年美國(guó)紐約修訂標(biāo)準(zhǔn)[10]。人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)陽(yáng)性40例，HLA-B27陰性29例。所有患者未接受藥物治療，排除哺乳期、腫瘤病史、近期感染或任何其他慢性炎癥疾病患者。另選擇同期體檢健康者22例作為健康對(duì)照組，其中男13例、女9例，年齡18～51歲，排除標(biāo)準(zhǔn)同上。兩組受試者性別及年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑 儀器：FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，德國(guó)Eppendorf 5702R臺(tái)式離心機(jī)，TYXH-Ⅰ-旋渦混合器(上海豫明儀器有限公司)。試劑：硫氰酸熒光素(FITC)-CD3抗體、藻紅蛋白花青苷7(PE-Cy7)-CD4抗體、別藻藍(lán)蛋白花青苷7(APC-Cy7)-CD8抗體、藻紅蛋白(PE)-CD16抗體、藻紅蛋白(PE)-56抗體、HLA-B27檢測(cè)試劑盒(HLA-B27Kit)、同型對(duì)照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE-Cy7、IgG1-APC-Cy7、IgG-PE、流式細(xì)胞儀7色校準(zhǔn)微球(BD FACS 7-ColorSetup Beads)、紅細(xì)胞裂解液/溶血素、磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.3HLA-B27、淋巴細(xì)胞亞群、NKT細(xì)胞檢測(cè)標(biāo)本制備 采集受試者空腹靜脈血1 mL，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝，4 h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測(cè)。HLA-B27：采用BD公司的FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀及配套試劑檢測(cè)HLA-B27，以試劑設(shè)定的Mark值為界值，小于Mark值為陰性，反之為陽(yáng)性。淋巴細(xì)胞亞群和NKT細(xì)胞標(biāo)本制備：取50 μL的全血與20 μL的抗體混勻，避光15 min，加450 μL的溶血素混勻，避光15 min，運(yùn)行FACS Diva 軟件，將標(biāo)本置于上樣盤(pán)中依次收集標(biāo)本，同時(shí)設(shè)空白、同型對(duì)照，每例收集2×104個(gè)細(xì)胞，結(jié)果用百分比表示。

2 結(jié) 果

2.1AC患者與健康對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群及NKT細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果比較 與健康對(duì)照組比較，AS患者CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD8+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1和表1。

2.2HLA-27陽(yáng)性組與陰性組外周血T淋巴細(xì)胞亞群及NKT細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果比較 與HLA-27陰性患者比較，HLA-27陽(yáng)性患者CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值升高，CD8+T細(xì)胞、NKT細(xì)胞表達(dá)水平降低，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2和表2。

注：A為健康對(duì)照組CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)；B為健康對(duì)照組NKT表達(dá)；C為病例組CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)；D為病例組NKT表達(dá)

圖1流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)病例組與健康對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群及NKT細(xì)胞

注：A為HLA-27陽(yáng)性組CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)；B為HLA-27陽(yáng)性組NKT表達(dá)；C為HLA-27陰性組CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)；D為HLA-27陰性組NKT表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-27陽(yáng)性組與陰性組 T淋巴細(xì)胞亞群及NKT細(xì)胞表1 病例組及健康對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群及NKT細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果比較

注：與健康對(duì)照組比較，*P<0.05

表2 HLA-27陽(yáng)性組與陰性組T淋巴細(xì)胞亞群及NKT細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果比較

3 討 論

AS的發(fā)病與HLA-B27分布一致，北方多于南方，多數(shù)在青少年晚期和20歲以前發(fā)病。迄今AS的確切發(fā)病機(jī)制尚未研究透徹，但是隨著免疫學(xué)動(dòng)物模型的研究與分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)免疫紊亂在AS發(fā)病機(jī)制起到重要作用。本研究結(jié)果顯示，AS患者外周血中CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平及CD4+/CD8+高于健康對(duì)照組；NKT細(xì)胞表達(dá)水平低于健康對(duì)照組，提示T淋巴細(xì)胞及NKT細(xì)胞參與了AS疾病的發(fā)展。研究表明Th1/Th2細(xì)胞比例失衡在AS發(fā)病中具有重要作用[11-12]，NKT細(xì)胞經(jīng)激活后可分泌大量的細(xì)胞因子，參與對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)控作用，可同時(shí)分泌Th1/Th2型細(xì)胞因子，其中包括IL-4可能影響Th1/Th2細(xì)胞免疫平衡。已證實(shí)IL-4是調(diào)控Th2細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，NKT細(xì)胞的一個(gè)顯著特點(diǎn)是受刺激后能夠很快產(chǎn)生大量的IL-4，而AS患者特征是NKT細(xì)胞數(shù)量減少，分泌IL-4能力下降，抑制Th2細(xì)胞的發(fā)育，從而導(dǎo)致Th1細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)，引發(fā)疾病。此外，NKT細(xì)胞可以有效清除凋亡小體，從而抑制自身反應(yīng)性B細(xì)胞的激活，而本研究顯示AS患者NKT細(xì)胞數(shù)量降低，導(dǎo)致B細(xì)胞活化，使患者體液免疫反應(yīng)狀態(tài)活躍，故引發(fā)疾病。

AS患者HLA-B27陰性率小于10%，發(fā)病機(jī)制可能與HLA-B27陽(yáng)性不同，其淋巴細(xì)胞表達(dá)是否存在不同，目前研究較少。本試驗(yàn)從HLA-B27陽(yáng)性、陰性2個(gè)方面研究，結(jié)果顯示二者之間CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)水平及CD4+/CD8+和NKT細(xì)胞表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示HLA-B27抗原存在與否對(duì)CD4+、CD8+細(xì)胞及NKT細(xì)胞水平的影響不大。

綜上所述，NKT細(xì)胞表達(dá)水平對(duì)AS發(fā)生起著重要作用，進(jìn)一步研究NKT細(xì)胞參與AS的發(fā)生機(jī)制，有可能為AS的診斷與治療提供依據(jù)，并有望成為臨床治療的靶點(diǎn)以及療效評(píng)價(jià)指標(biāo)。

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