高血壓患者RYR-3基因多態(tài)性與大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中的相關(guān)性研究

陳穎聰，錢(qián)安民，張建軍，張志軍，薛常虎，艾妮

既往研究已發(fā)現(xiàn)Ca2+同高血壓密切相關(guān)，并可通過(guò)給予鈣離子拮抗劑行降血壓治療[1,2]。有研究發(fā)現(xiàn)Ca2+可能還參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥、增殖、分化和氧化應(yīng)激等，是動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）發(fā)生發(fā)展的重要影響因素[3,4]。蘭尼堿受體-3（ryanodine receptor 3，RYR-3）是體內(nèi)調(diào)控Ca2+濃度的主要受體之一，其基因多態(tài)性可能與AS相關(guān)[5]。本研究對(duì)高血壓人群中RYR-3基因多態(tài)性與大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中（Large Artery Atherosclerosis，LAA）的相關(guān)性進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013年1月至2015年12月我科治療的高血壓合并LAA患者232例為卒中組，入組標(biāo)準(zhǔn)：年齡45～80歲，出生并長(zhǎng)期生活于陜西的漢族人；高血壓診斷符合2010年《中國(guó)高血壓防治指南》診斷標(biāo) 準(zhǔn)[6]；經(jīng)頭顱CT和（或）MR檢查確診為缺血性卒中，且LAA診斷符合TOAST（Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment）分型標(biāo)準(zhǔn)[7]。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他類(lèi)型的缺血性卒中；肝、腎等重要臟器合并嚴(yán)重器質(zhì)性病變或功能障礙；合并顱內(nèi)或全身感染；惡性腫瘤；精神病、有意識(shí)障礙。參照卒中組的年齡和性別構(gòu)成，選擇同期在我院治療的患有高血壓非卒中，且不伴頸部血管狹窄的患者200例為高血壓組，高血壓診斷符合2010年《中國(guó)高血壓防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)；采用頸部血管超聲進(jìn)行評(píng)價(jià)有無(wú)頸部血管狹窄，將中膜厚度≥1.5 mm判定為血管狹窄。另選擇同期于我院體檢中心接受體檢的非高血壓健康體檢者200例為對(duì)照組。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 收集臨床指標(biāo) 包括患者年齡、性別、吸煙史、體重指數(shù)（body weight index，BWI）、糖尿病、血脂異?；疾∏闆r，及血糖、血脂等生化指標(biāo)。糖尿病診斷和分類(lèi)按照2010年《中國(guó)2型糖尿病防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；血脂異常診斷符合以下標(biāo)準(zhǔn)之一或多條：甘油三酯（triglyceride，TG）≥1.7 mmol/L，總膽固醇（total cholesterol，TC）≥5.18 mmol/L，低密度脂蛋白膽固 醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）≥ 3.37mmol/L，高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）≤1.04 mmol/L；吸煙定義為平均每天≥1支，至少持續(xù)3月。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測(cè) 采集所有受試者清晨空腹時(shí)外周靜脈血2 mL，按照氯仿飽和酚法提取基因組DNA。采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測(cè)RYR-3基因rs877087和rs2229116多態(tài)性。PCR反應(yīng)體系包括：10×Buffer 2.5 μL，上、下游引物各1 μL（上游引物：5’-dAAGAGGAAGAAGCGATGGT-3’，下游引物：5’-dCAGATGAAGCATTTGGTCTCCAT-3’），dNTP 混合物 2 μL，TaqDNA 聚合酶 0.25 μL，模板DNA1 μL，不足部分由滅菌蒸餾水補(bǔ)足。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 4 min，然后按照 95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s、72℃30 s順序循環(huán)30周期，最后72℃延長(zhǎng)3 min。加入蝦堿性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP）反應(yīng)液，按37℃40 min、85℃5 min進(jìn)行反應(yīng)。延伸反應(yīng)體系包括：延伸引物0.2 μL，去離子水0.6 μL，iplex緩沖液0.2 μL，iplex酶0.4 μL，反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；56 ℃ 5 s，80 ℃ 5 s，5個(gè)循環(huán)；按照該順序循環(huán)40周期，72 ℃再延長(zhǎng)3 min。將樣本置于質(zhì)譜儀中檢測(cè)，采用TYPER軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料均服從正態(tài)分布，結(jié)果以（±s）表示，2組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料結(jié)果以構(gòu)成百分比（%）表示，χ2檢驗(yàn)?；蛐头植疾捎肏ardy-Weinberg平衡定律檢驗(yàn)；采用多因素Logistic回歸分析法評(píng)價(jià)各因素與缺血性卒中間的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組臨床資料比較

卒中組232例，男146例，女86例；年齡（57.6±7.2）歲；BWI（22.5±3.6）kg/m2；吸煙108例（46.6%）；糖尿病64例（27.6%），血脂異常156例（67.2%）；收縮壓（systolic blood pressure，SBP）（138.5±18.2）mmHg，舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）（88.4±11.0）mmHg；TG（1.5±0.5）mmol/L，TC（4.6±1.9）mmol/L，LDL-C（2.9±0.9）mmol/L，HDL-C（1.2±0.3）mmol/L；空腹血糖（5.4±1.4）mmol/L。高血壓組200例，男123例，女77例；年齡（56.7±7.3）歲；BWI（22.7±3.8）kg/m2；吸煙 62例（31.0%）；糖尿病26例（13.0%），血脂異常118例（56.0%）；SBP（139.0±19.3）mmHg，DBP（88.7±11.9）mmHg；TG（1.5±0.6）mmol/L，TC（4.2±2.0）mmol/L，LDL-C（2.7±0.9）mmol/L，HDL-C（1.2±0.3）mmol/L；空腹血糖（5.1±1.2）mmol/L。對(duì)照組200例，男118例，女82例；年齡（56.5±7.1）歲；BWI（23.1±3.4）kg/m2；吸煙59例（29.5%）；糖尿病28例（14.0%），血脂異常108例（54.0%）；SBP（120.4±14.2）mmHg，DBP（78.2±10.3）mmHg；TG（1.4±0.5）mmol/L，TC（4.1±2.1）mmol/L，LDL-C（2.6±0.8）mmol/L，HDL-C（1.2±0.2）mmol/L；空腹血糖（5.0±1.3）mmol/L。3組年齡、性別、BWI、TG、HDL-C等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。卒中組吸煙、糖尿病、血脂異常、TC、LDL-C及空腹血糖均高于高血壓組和對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。卒中組和高血壓組入院基線(xiàn)SBP和DBP均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），卒中組與高血壓組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.2 基因型和等位基因分布

RYR-3基因rs877087位點(diǎn)基因型包括TT、CT和CC三種，等位基因包括T和C兩種，卒中組的基因型和等位基因與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；高血壓組與對(duì)照組，高血壓組與卒中組比較，基因型和等位基因的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。RYR-3基因rs2229116位點(diǎn)基因型包括AA、AG和GG三種，等位基因包括A和G兩種，高血壓組的基因型和等位基因與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；卒中組的基因型和等位基因與高血壓組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 多因素Logistic回歸分析

對(duì)于高血壓患者，吸煙、糖尿病、RYR-3基因rs2229116位點(diǎn)AA基因型均是發(fā)生大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表2、表3。

表1 基因型和等位基因分布[例(%)]

表2 變量的賦值

表3 多因素Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

AS作為缺血性卒中發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)，一直都是心腦血管疾病的研究熱點(diǎn)[9]。目前學(xué)者多認(rèn)為AS是內(nèi)在基因和外在環(huán)境共同作用的結(jié)果，Ca2+作為聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)外反應(yīng)的重要細(xì)胞信使，近年來(lái)，相繼有研究發(fā)現(xiàn)Ca2+可能與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其可能的機(jī)制在于：Ca2+作為重要的細(xì)胞信號(hào)通路信使，直接參與AS相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控；Ca2+參與多種物質(zhì)代謝，可間接參與AS形成；細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化與炎癥發(fā)生相關(guān)，AS作為一種慢性炎癥反應(yīng)，兩者之間也存在聯(lián)系；Ca2+可參與巨噬細(xì)胞凋亡過(guò)程，可能與AS斑塊破裂相關(guān)[3,4,10-13]。

RYRs主要位于肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，參與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度調(diào)節(jié)，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，RYRs包含RYR-1、RYR-2和RYR-3三種類(lèi)型，其中RYR-1主要分布于骨骼肌，RYR-2主要位于心肌，RYR-3主要存在血管內(nèi)皮細(xì)胞和多種神經(jīng)結(jié)構(gòu)組織中[5]。最早有研究發(fā)現(xiàn)RYR-3基因多態(tài)性可能與阿爾茲海默病及乳腺癌相關(guān)，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相繼有研究發(fā)現(xiàn)RYR-3基因多態(tài)性可能還與AS形成相關(guān)[5,14-16]。目前研究發(fā)現(xiàn)RYR-3基因存在多個(gè)突變位點(diǎn)，包括rs877087、rs2229116、rs2132207、rs658750、rs2077268和rs4780144等，一項(xiàng)納入1 262例日本人群的研究發(fā)現(xiàn)rs877087和rs2229116基因多態(tài)性與AS相關(guān)[5]。還有研究發(fā)現(xiàn)艾滋病患者中RYR-3基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度相關(guān)[15]。吳資波等[17]研究發(fā)現(xiàn)RYR-3基因rs877087、rs2229116和rs2132207三個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性均與腦卒中發(fā)生無(wú)明顯聯(lián)系。筆者總結(jié)既往多項(xiàng)研究認(rèn)為這種結(jié)果不一致的原因首先在于各研究的研究對(duì)象無(wú)嚴(yán)格統(tǒng)一的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)。本研究在前期設(shè)計(jì)階段認(rèn)為既然長(zhǎng)久以來(lái)大多數(shù)研究證實(shí)Ca2+在高血壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，那么，為排除與之相關(guān)的偏倚，本研究以高血壓患者作為研究人群，探討該人群中RYR-3基因rs877087、rs2229116位點(diǎn)多態(tài)性與LAA的相關(guān)性。

本研究顯示RYR-3基因rs877087位點(diǎn)基因型和等位基因，僅在卒中組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，卒中組的基因型TT和等位基因T的頻率高于對(duì)照組，提示rs877087位點(diǎn)T＞C突變可能影響RYR-3穩(wěn)定及對(duì)低Ca2+的調(diào)控，進(jìn)而影響AS的發(fā)生發(fā)展，但在高血壓組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能有兩種原因：RYR-3基因rs877087多態(tài)性與高血壓發(fā)生無(wú)關(guān)；兩者相關(guān)，但由于本研究樣本量不足，檢驗(yàn)效能低，而導(dǎo)致未發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)系。本研究顯示關(guān)于rs2229116位點(diǎn)的基因多態(tài)性，高血壓組與對(duì)照組比較，卒中組與高血壓組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs2229116位點(diǎn)多態(tài)性與高血壓及AS發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)。本研究顯示RYR-3基因rs2229116位點(diǎn)基因型AA是高血壓患者發(fā)生LAA的危險(xiǎn)因素。另外，本研究還提示吸煙和2型糖尿病是高血壓患者發(fā)生LAA的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，再次強(qiáng)調(diào)戒煙和控制血糖對(duì)缺血性卒中防治的意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)高血壓患者RYR-3基因rs2229116多態(tài)性與LAA相關(guān)，提示對(duì)于高血壓患者，如基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RYR-3基因rs2229116位點(diǎn)基因型為AA，合理應(yīng)用鈣離子拮抗劑降壓可能有助于LAA預(yù)防。當(dāng)然，目前研究發(fā)現(xiàn)缺血性卒中可能與多基因共同表達(dá)相關(guān)，RYR-3基因與其他基因相互作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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