芒果苷通過抑制氧化應(yīng)激及抗凋亡作用保護(hù)大鼠顱腦損傷

譚支強(qiáng)

創(chuàng)傷性顱腦損傷（Traumatic Brain Injury，TBI）的發(fā)生率逐年增加，已成為神經(jīng)外科常見的疾病之一[1]。TBI后顱內(nèi)繼發(fā)水腫、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等是患者死亡的主要原因[2,3]。因此，抑制顱內(nèi)水腫及氧化應(yīng)激以及抗神經(jīng)凋亡能加速TBI患者恢復(fù)。芒果苷（Mangiferin，MAN）是一類雙苯吡酮類黃酮類化合物，具有抗糖尿病、抗腫瘤、抗炎、抗氧化等作用[4,5]。本實(shí)驗(yàn)探討MAN對(duì)大鼠TBI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由上海交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 Freeny's自由落體架由上海交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，MAN（純度≥98%，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）；大鼠丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）Elisa試劑盒、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）（購(gòu)于上海博谷公司）；大鼠Bax，Bcl-2一抗，DAB顯色試劑盒（購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司）；1%戊巴比妥鈉（購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司）；紫外分光光度計(jì)（購(gòu)于美國(guó)Bausch Lomb公司）；0.9%氯化鈉注射液（購(gòu)于北京雙鶴藥業(yè)）；注射用青霉素鈉（購(gòu)于瑞陽制藥公司）；Image Pro Plus 6.0軟件（美國(guó)Media Cybernetics公司）。

1.2 方法

1.2.1 TBI模型的制作 術(shù)前禁食8 h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定于Freeny's支架上，消毒，切開顱頂部皮膚后剝離骨膜，充分暴露顱骨，利用微型電鉆切開直徑約5 mm的圓形骨窗，將50 g打擊器置于20 cm高度自由落下撞擊骨窗，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮。術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)。神經(jīng)功能缺損評(píng)分＞2分表明造模成功。假手術(shù)組只制作骨窗，不打擊顱腦。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 60只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組、模型組、MAN低濃度組（10 mg/kg）、MAN中濃度組（20 mg/kg）和MAN高濃度組（40 mg/kg），每組12只。MAN低、中、高組每日通過腹腔注射MAN 1次，連續(xù)注射7 d。假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。

1.2.3 神經(jīng)功能評(píng)估 采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified Neurological Severity Score，mNSS）[6]評(píng)估術(shù)后各組大鼠3 d和7 d的神經(jīng)功能缺損情況，包括：肢體運(yùn)動(dòng)測(cè)試6分，感覺測(cè)試2分，平衡木測(cè)試6分，反射反應(yīng)及異?；顒?dòng)4分。

1.2.4 顱內(nèi)水腫的測(cè)定 造模7 d后，各組取4只大鼠，取出腦組織后稱重，隨后放入80℃烘箱中放置72 h，待完全風(fēng)干后再次稱重。

1.2.5 Elisa法檢測(cè)損傷腦組織氧化應(yīng)激因子含量及活性 造模7 d后，各組取4只大鼠腦組織，保留損傷灶及邊緣2 mm區(qū)域，每個(gè)腦組織切分為2份，分別用于氧化應(yīng)激因子和Bax/Bcl-2蛋白的檢測(cè)。充分剪碎后研磨，利用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液進(jìn)行稀釋，加終止液后混勻，測(cè)定450 nm吸光度，根據(jù)吸光度計(jì)算MDA、CAT、SOD、GSH含量。

1.2.6 Western-blot法檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)造模7 d后，取出損傷區(qū)域腦組織，充分剪碎后研成勻漿，3 mL/g蛋白裂解液充分裂解后，以10 000 g離心30 min，取出上清液。BCA法測(cè)定總蛋白濃度。經(jīng)過加樣、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗（1:1 500）孵育過夜，二抗（中衫金橋）1∶5 000孵育3 h，脫脂奶粉充分洗凈后加入顯色劑顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)成像，Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算各組條帶灰度值。1.2.7免疫組織化學(xué)染色觀測(cè) 造模7 d后，各組取4只大鼠腦組織，保留損傷灶及邊緣2 mm區(qū)域，10%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，從損傷部位的腦組織連續(xù)切片，片厚5 μm。切片后行Caspase-3免疫組織化學(xué)染色，熒光倒置顯微鏡下觀察，Caspase-3陽性鏡下可呈黃色或棕黃色，形態(tài)不規(guī)則。200倍鏡視野下，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，觀察Caspase-3染色及利用Image Pro Plus 6.0軟件檢測(cè)Caspase-3蛋白表達(dá)平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能比較

造模后3 d和7 d，mNSS評(píng)分明顯升高（P＜0.05），經(jīng)過芒果苷治療后，MAN 3個(gè)濃度組mNSS評(píng)分低于假手術(shù)組（P＜0.05）；MAN中濃度組低于低濃度組，高濃度組低于低、中濃度組，呈劑量依賴趨勢(shì)（P＜0.05），見表1。

表1 各組造模后mNSS評(píng)分比較（±s，n=12）

表1 各組造模后mNSS評(píng)分比較（±s，n=12）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與MAN低濃度組比較，③P＜0.05；與MAN中濃度組比較，④P＜0.05

7 d 0 8.7±0.8①7.2±0.9②6.4±0.7②③5.5±0.6②③④19.343 0.007組別假手術(shù)組模型組MAN低濃度組MAN中濃度組MAN高濃度組F值P值只數(shù)12 12 12 12 12 3 d 0 12.1±1.3①9.5±0.9②8.6±0.7②③7.3±0.8②③④14.862 0.018

2.2 芒果苷對(duì)TBI大鼠腦水腫情況的影響

假手術(shù)組、模型組、MAN低濃度組、MAN中濃度組、MAN高濃度組的腦組織含水量分別為（68.3±4.4）%、（82.1±4.9）%、（79.2±4.7）%、（74.8±4.4）%、（70.4±4.8）%，模型組的腦組織含水量較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.05）。MAN低濃度組和中濃度組的腦組織含水量較模型組降低（P＜0.05），而高濃度組腦含水量明顯低于低、中濃度組腦組織含水量（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠MDA、CAT、SOD及GSH活性比較

造模后，模型組MDA含量明顯升高，CAT、SOD、GSH含量明顯降低（P＜0.05），經(jīng)MAN治療后，各組氧化應(yīng)激因子明顯逆轉(zhuǎn)（P＜0.05），中濃度組高于低濃度組，高濃度組高于低、中濃度組，呈劑量依賴趨勢(shì)（F=10.967，17.455，9.174，13.021，P＜0.05），見表2。

2.4 Western blot法檢測(cè)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)

各組大鼠腦組織Bax蛋白表達(dá)分別為（1.1±0.2）、（11.8±0.9）、（9.1±0.8）、（7.3±0.8）、（5.6±0.7），模型組中凋亡蛋白Bax表達(dá)提高（P＜0.05），而經(jīng)過MAN治療后，損傷腦組織中Bax表達(dá)得到明顯抑制，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各濃度組之間，中濃度組低于低濃度組，而高濃度組低于低、中濃度組（F=16.927，P＜0.05）；各組大鼠腦組織Bcl-2蛋白表達(dá)分別為（9.3±0.9）、（1.0±0.2）、（3.2±0.3）、（3.9±0.4）、（5.7±0.6），模型組中Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.05），而經(jīng)過MAN治療后，損傷腦組織中Bcl-2表達(dá)得到明顯提升（P＜0.05），各濃度組之間，中濃度組高于低濃度組，而高濃度組高于低、中濃度組（F=12.852，P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)

2.5 免疫組織化學(xué)染色觀察

各組Caspase-3蛋白均表達(dá)于腦皮質(zhì)，假手術(shù)組可見少量Caspase-3表達(dá)，模型組可見大量Caspase-3蛋白，MAN組Caspase-3蛋白依次減少，見圖2。假手術(shù)組、模型組、MAN低濃度組、MAN中濃度組和MAN高濃度組的Caspase-3表達(dá)平均光密度分別為（13.9±2.8）、（94.7±9.6）、（82.1±8.8）、（67.9±7.1）、（55.4±6.3），模型組的Caspase-3表達(dá)高于假手術(shù)組（P＜0.05）。MAN組Caspase-3表達(dá)均低于模型組（P＜0.05）。MAN各組之間，中濃度組低于低濃度組，高濃度組低于低、中濃度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組氧化應(yīng)激因子表達(dá)（±s）

表2 各組氧化應(yīng)激因子表達(dá)（±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與MAN低濃度組比較，③P＜0.05；與MAN中濃度組比較，④P＜0.05

組別假手術(shù)組模型組MAN低濃度組MAN中濃度組MAN高濃度組F值P值只數(shù)4 4 4 4 4 MDA/(nmol/mg)16.7±1.8 43.8±2.1①31.4±2.2②22.3±1.8②③19.7±1.9②③④10.967 0.029 CAT/(U/mg)183.9±11.4 37.8±10.1①79.8±9.7②99.1±11.2②③141±12.6②③④17.455 0.003 SOD/(U/mg)18.9±1.5 4.1±1.3①6.4±1.4②7.5±1.6②③9.9±1.5②③④9.174 0.014 GSH/(U/mg)42.8±1.9 8.9±1.7①14.8±1.9②21.6±1.9②③31.4±2.1②③④13.021 0.008

3 討論

TBI包括原發(fā)腦損傷（Primary Brain Injury，PBI）和繼發(fā)腦損傷（Secondary Brain Injury，SBI）[7]，PBI后顱內(nèi)發(fā)生一系列病理生理改變，如腦組織水腫、氧化應(yīng)激及炎性因子代謝異?；蛏窠?jīng)細(xì)胞凋亡和壞死等[8]。大量研究證明，腦水腫、氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)以及神經(jīng)凋亡是TBI后繼發(fā)性腦損傷的主要原因[9]。

顱內(nèi)水腫在TBI病情發(fā)展中占據(jù)重要作用[10]，TBI后血腦屏障發(fā)生變化，腦微循環(huán)障礙，引起損傷區(qū)及周圍組織含水量增加，且TBI后可發(fā)生腦自由基、前列腺素及神經(jīng)肽類變化，均可引起腦水腫。本研究通過Feeney氏自由落體法制作的TBI模型，通過干濕法可測(cè)量腦水腫情況發(fā)現(xiàn)，TBI后腦水腫明顯加劇，而經(jīng)過MAN治療后，水腫指數(shù)明顯下調(diào)，mNSS評(píng)分顯示大鼠神經(jīng)功能明顯提高，提示MAN可通過抑制損傷腦組織水腫從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

圖2 各組大鼠Caspase-3表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色×200）

氧化應(yīng)激是TBI后形成繼發(fā)性損傷的重要因素之一[11]，TBI后顱內(nèi)氧自由基大量增加，自由基破壞生物膜結(jié)構(gòu)的完整性和通透性，使細(xì)胞鈣通道開發(fā)，大量鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞變性、凋亡和壞死。MDA是膜脂過氧化終產(chǎn)物，可直接反映體內(nèi)膜脂過氧化程度，其含量可間接反映呼吸鏈酶對(duì)細(xì)胞的攻擊程度[12]。SOD催化過氧陰離子的歧化反應(yīng)，是細(xì)胞內(nèi)主要的自由基清除劑，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，SOD含量可反映機(jī)體細(xì)胞內(nèi)源性氧自由基清除能力[13]。CAT科催化分解過氧化氫，避免過氧化氫與氧在鐵螯合物作用下生產(chǎn)有害的氫氧根離子，CAT主要存在于紅細(xì)胞和機(jī)體某些組織內(nèi)，是過氧化物酶體的標(biāo)志酶。GSH是一種重要的過氧化物分解酶，可將過氧化物還原成無毒性的羥基化合物，其含量高低可間接反映機(jī)體清除過氧化物的能力[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，TBI后腦組織氧化應(yīng)激因子MDA明顯上調(diào)，而CAT、SOD、GSH含量得到抑制，經(jīng)MAN治療后，MDA含量明顯下調(diào)，CAT、SOD、GSH含量明顯提高，提示MAN可通過抑制MDA，上調(diào)CAT、SOD、GSH含量抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

凋亡是細(xì)胞的自毀機(jī)制，在TBI后病理生理機(jī)制中發(fā)揮重要作用，TBI后神經(jīng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激及炎性因子刺激，啟動(dòng)一系列控制程序，其中Bcl家族與凋亡的關(guān)系最為密切。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，能掌控細(xì)胞存活的分子調(diào)控點(diǎn)，能通過線粒體膜抑制一些凋亡誘導(dǎo)因子，如Caspase和細(xì)胞色素C的釋放，促使細(xì)胞存活[15]。Bax是細(xì)胞內(nèi)主要的促凋亡因子之一，Bax過表達(dá)可拮抗Bcl-2，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]，病理?xiàng)l件下，Bax可促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase，加速細(xì)胞凋亡。因此，Bax大量表達(dá)可能是導(dǎo)致顱腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的主要原因。目前研究認(rèn)為，Bcl-2和Bax對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控作用相互拮抗，存在動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)Bax過表達(dá)，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，TBI后，腦組織Bax表達(dá)水平提高，Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，而經(jīng)MAN治療后Bax蛋白表達(dá)受到明顯抑制，Bcl-2水平提高，并且，MAN可明顯抑制TBI大鼠腦組織Capase-3表達(dá)，提示MAN可通過抑制Bax/Bcl-2和Caspase-3途徑發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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