富硒治療對大鼠急性一氧化碳中毒性腦病的作用

李金蘭，劉群會，曹學(xué)兵，賈敏，譚明會，聶淑科,3，陳貴勤

急性一氧化碳（carbon monoxide，CO）中毒是我國冬春季常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率和死亡率在我國職業(yè)和非職業(yè)危害中均占前位。急性CO中毒性腦病是中毒后的常見神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，占急性CO中毒的10%～30%，占重癥CO中毒的50%，其發(fā)病率國內(nèi)為10%～30%，國外為0.8%～43%[1-3]。CO中毒的急性階段不但抑制血紅蛋白與氧結(jié)合，與氧的解離也發(fā)生障礙，組織細(xì)胞的氧供及利用氧的能力下降，一旦缺氧即可造成嚴(yán)重的神經(jīng)元破壞[4-6]。缺氧、氧化應(yīng)激、炎癥等激活某些信號系統(tǒng)，一系列的基因表達(dá)發(fā)生改變，促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[7]。硒（Se）以硒蛋白的形式存在于機(jī)體內(nèi)，是主要抗氧酶--谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）的必要組成部分，GPx通過含硒代半胱氨酸殘基的氧化還原位點，參與調(diào)節(jié)激素、細(xì)胞信號傳導(dǎo)及抗氧化[8]。小白蛋白（parvalbumin，PV）屬于鈣緩沖蛋白，可減少神經(jīng)元損傷后出現(xiàn)的鈣超載，進(jìn)而阻斷Caspase-3的激活，保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性及鈣超載誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷，在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣聚集和抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[9,10]。因此，Caspase-3可能是硒及鈣緩沖蛋白相互關(guān)聯(lián)的一個關(guān)鍵點。本文研究富硒對急性CO中毒大鼠腦損傷后腦組織PV和Caspase-3表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，由蘇州愛爾特麥科技有限公司提供。喂養(yǎng)于條件相對恒定的環(huán)境，室內(nèi)溫度（23±1）℃，濕度（50±2）%，光照與黑夜各半（8～20時為光照時間）。

1.1.2 主要設(shè)備和試劑 99.99%CO氣體由北京兆格氣體科技有限公司提供；硒麥寶片，規(guī)格為0.5g/片，含硒量（以se計）91.59 μg/g，批號為QS610113016008，由恩施康世道生物技術(shù)發(fā)展有限公司提供；兔抗鼠PV抗體和兔抗鼠Caspase-3均購于美國Novus Biologicals公司，β-tubulin抗體購于武漢安特捷生物技術(shù)有限公司；免疫組化試劑盒（兔/鼠），購于武漢谷歌生物技術(shù)有限公司。Image-J圖像分析軟件購于美國National Institutes of Health公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將60只大鼠隨機(jī)分為正常對照組（BC組）、急性CO中毒組（CO組）、低硒治療組（L-Se組）、中硒治療組（M-Se組）、高硒治療組（H-Se組），每組各12只。BC組和CO組在造模前30 d及造模后每天對大鼠行純水4 mL/kg灌胃；L-Se組、M-Se組、H-Se組分別在造模前30 d及造模后每天對大鼠行50 μg/(kg·d)、200 μg/(kg·d)、500 μg/(kg·d)的硒麥寶片+純水4 mL/kg灌胃補(bǔ)硒。造模后7 d、14 d為時相點。

1.2.2 CO中毒動物模型制備 動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除對照組外的其余4組腹腔內(nèi)注入純CO氣體制備動物模型[11]：造模前1 d大鼠禁食、禁水，清晨7時將大鼠稱重后，首次腹腔注射130 mL/kg的CO，后每隔4 h追加1次65 mL/kg，共追加3次。造模過程中每10～20 min觀察大鼠神志行為變化并記錄。每次腹腔注射CO前取尾血0.1 mL抗凝入0.4 mL氨液（0.4 mol/L），并加入低亞硫酸鈉20 mg混勻。5～10 min測定535 nm、578 nm波長吸光度，監(jiān)測血碳氧血紅蛋白（HbCO）濃度，公式為：HbCO（%）=（2.44×A535/A578-2.68）×100%。以血HbCO水平維持在50%以上為中毒指標(biāo)。注射完畢將大鼠迅速移到空氣流通的地方。BC組采用腹腔等量分次空氣注射。造模完畢 24 h內(nèi)給予存活大鼠牛奶、花生碎、涼開水灌胃，通風(fēng)保暖，室溫保持（24±2）°C，環(huán)境濕度（40±10）%。

1.2.3 大鼠外周臟器病理檢查和大腦皮質(zhì)免疫組織化學(xué)檢查 造模后第7天、第14天，大鼠用3.6%水合氯醛（1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，仰臥位固定，暴露心臟，左心室心尖行心內(nèi)插管，剪開右心房，灌注生理鹽水至右心房流出液清亮為止，再用4%多聚甲醛溶液心內(nèi)灌注固定至頭及四肢發(fā)硬，斷頭法取出全腦，再取外周肝臟、雙腎組織，置于4%多聚甲醛中固定10～20 h，冠狀面取材后脫水、石蠟包埋，用超薄切片機(jī)切成4 μm的連續(xù)切片。肝臟、雙腎組織行常規(guī)組織病理HE染色，腦組織行免疫組織化學(xué)染色。

1.2.4 Western blot法檢測大腦皮質(zhì)PV和失活Caspase-3蛋白的表達(dá) 每組取6只大鼠，經(jīng)乙醚麻醉，快速處死，取大腦皮質(zhì)，采用組織裂解法提取總蛋白。用考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒測定蛋白含量，按4 μg/μL蛋白制成樣品，-80℃保存。制備5%濃縮膠和10%分離膠的聚丙烯酰胺垂直平板凝膠，40 μg總蛋白經(jīng)70 V電壓電泳2.5 h后，電轉(zhuǎn)280 mA、1 h轉(zhuǎn)印至PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后，用含5%小牛血清蛋白室溫封閉1 h。按分子量大小切取條帶，分別加入兔抗大鼠PV抗體（稀釋度1∶ 1 000），兔抗大鼠Caspase-3抗體（稀釋度1∶1 000），4℃孵育過夜，TBST洗脫3次，每次10 min；加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體（稀釋度1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST洗脫3次，每次10 min。ECL發(fā)光、顯影、定影、掃描，采用Image-J圖像分析軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。重復(fù)測定3次，取其均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

PV采用陽性細(xì)胞計數(shù)法：每張切片計數(shù)高倍鏡下（400倍）10個視野皮質(zhì)放射冠內(nèi)有核陽性細(xì)胞數(shù)。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，計數(shù)資料采用χ2檢驗，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝臟組織組織學(xué)比較

造模后7 d、14 d，BC組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，匯管區(qū)無纖維化；CO組大鼠肝細(xì)胞未見明顯水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)無擴(kuò)大增寬，無膠原沉積，未見纖維間隔和假小葉形成；L-Se組、M-Se組和H-Se組的肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞無明顯變性、壞死，匯管區(qū)無膠原沉積，無明顯纖維間隔形成，與BC組和CO組比較，無明顯病理結(jié)構(gòu)改變，見圖1。

2.2 各組大鼠腎組織組織學(xué)比較

造模后7 d、14 d，BC組腎臟皮質(zhì)區(qū)結(jié)構(gòu)正常，小管管腔完整，腔面可見刷狀緣，間質(zhì)無充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤；CO組細(xì)胞無腫脹，小管刷狀緣無明顯受損，小管上皮細(xì)胞無缺血壞死，與BC組的腎臟皮質(zhì)結(jié)構(gòu)比較無明顯變化。L-Se組、M-Se組和H-Se組的腎小球體積無增大，腎小球囊腔正常，細(xì)胞數(shù)未見增多，小管上皮細(xì)胞未見腫脹、壞死、刷狀緣脫落，無空泡樣、顆粒樣變性，無炎性細(xì)胞浸潤，與BC組、CO組比較無明顯病理性改變，見圖2。

2.3 各組大鼠腦皮質(zhì)免疫組化染色比較

PV免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿呈棕褐色的圓形或卵圓形顆粒。造模后7 d、14 d，相較于BC組，CO組大鼠皮質(zhì)內(nèi)PV陽性細(xì)胞數(shù)大幅度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相較于CO組，L-Se組的PV陽性細(xì)胞數(shù)無明顯變化（P＞0.05），M-Se組第7天的PV陽性細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），第14天的PV陽性細(xì)胞數(shù)增多明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。L-Se組在7 d和14 d的PV陽性細(xì)胞數(shù)比BC組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。M-Se組在7 d和14 d的PV陽性細(xì)胞數(shù)較L-Se組增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；14 d與BC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；H-Se組在7 d和14 d的PV陽性細(xì)胞數(shù)較CO組、L-Se組、M-Se組明顯增多，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與BC組無明顯差異（P＞0.05），見圖3。

圖1 各組大鼠肝臟病理組織學(xué)觀察（HE染色，×200）

圖2 各組大鼠腎皮質(zhì)病理組織學(xué)結(jié)果（HE染色，×400）

2.4 各組大鼠腦皮質(zhì)PV和Caspase-3蛋白表達(dá)結(jié)果

造模后7 d、14 d，CO組的大鼠腦皮質(zhì)內(nèi)PV的表達(dá)量低于BC組，Caspase-3的表達(dá)量高于BC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；L-Se組在7 d和14 d的PV表達(dá)量較CO組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但仍低于BC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Caspase-3表達(dá)量仍高于BC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；M-Se組在7 d和14 d的PV表達(dá)量較CO組、L-Se組無明顯變化，低于BC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），Caspase-3表達(dá)量較CO組、L-Se組減少，仍高于BC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；H-Se組在7 d和14 d的PV表達(dá)量較CO組、L-Se組增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與BC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），Caspase-3的表達(dá)量較CO組、L-Se組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與BC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

3 討論

CO是急性中毒導(dǎo)致死亡最常見的窒息性氣體，是較常見的職業(yè)性及生活性中毒，CO中毒能引起以中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)功能損害為主的多臟器損害[2]。急性CO中毒性腦病中最嚴(yán)重的是部分患者急性中毒癥狀消失后，經(jīng)過數(shù)天或數(shù)周表現(xiàn)正常或接近正常的“假愈期”，會出現(xiàn)以癡呆為主的精神神經(jīng)癥狀，稱為急性CO中毒遲發(fā)性腦病[12]（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP），其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，可能與谷氨酸興奮毒性、氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、細(xì)胞凋亡等多種因素有關(guān)[13,14]。

CO中毒后腦組織缺血缺氧可顯著誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞內(nèi)鈣超載的形成，介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡[5,6]；氧化應(yīng)激本身也可誘導(dǎo)產(chǎn)生自由基，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的大量增加[15,16]。缺氧缺血組織因能量降低使細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，可激活鈣蛋白酶并介導(dǎo)鈣蛋白酶從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞膜易位，使活化的Caspase-12進(jìn)一步激活Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。凋亡過程中，上游產(chǎn)物（主要復(fù)合物cyt CApaf-1，Caspase-9d）活化下游產(chǎn)物Caspase-3、6、7。Caspase-3的活化標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的開始，因此Caspase-3也被稱為死亡蛋白[18]。文獻(xiàn)報道CO中毒患者尸檢時發(fā)現(xiàn)其腦組織皮質(zhì)、海馬、基底核區(qū)存在大量細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。國內(nèi)外學(xué)者也證實大鼠CO中毒3 d后神經(jīng)元開始凋亡，7 d達(dá)到高峰，說明CO中毒可引起細(xì)胞凋亡[19]。本研究顯示，在大鼠CO中毒前后灌胃補(bǔ)充硒可顯著降低Caspase-3活性，減少繼發(fā)性神經(jīng)元損傷。

圖3 造模后第7天和第14天各組大鼠腦皮質(zhì)PV免疫組化結(jié)果

硒是人體重要的微量元素，在人體以硒蛋白的形式存在。由于硒的治療劑量和中毒劑量接近，本實驗在給予灌胃補(bǔ)硒治療后行HE染色觀察大鼠肝臟和腎臟組織，結(jié)果表明大鼠的外周肝臟、腎組織形態(tài)無明顯損傷，說明給藥劑量為安全劑量。硒是GPx的必要組成部分，Chris等[20]發(fā)現(xiàn)GPx可保護(hù)紅細(xì)胞中的血紅蛋白不受H2O2和抗壞血酸誘導(dǎo)生的氧化，其獨特之處是其活性不受疊氫物或氰化物的抑制，減少脂質(zhì)的氧化，抑制Ca2+超載。PV屬于鈣緩沖蛋白，可減少神經(jīng)元損傷后出現(xiàn)的鈣超載，進(jìn)而阻斷Caspase-3的激活，保護(hù)神經(jīng)元免受興奮性及鈣超載誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[9]。

圖4 造模后第7天（A）和第14天（B）各組大鼠腦皮質(zhì)PV和Caspase-3 Western blotting結(jié)果

眾所周知，CO中毒后遲發(fā)性腦病防治一直是醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的難點，目前國內(nèi)外關(guān)于富硒藥物對急性CO中毒的防治未見相關(guān)研究，本研究通過建立大鼠腹腔注射CO中毒遲發(fā)性腦病模型，發(fā)現(xiàn)高劑量的硒治療可明顯上調(diào)PV，減少Caspase-3的活化，保護(hù)急性CO腦病的腦組織損傷，而低劑量和中劑量的補(bǔ)硒治療對急性CO中毒性腦病后腦組織的PV和Caspase-3表達(dá)的變化無明顯影響。

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